Источники ДНК для клонирования

Существует три различных источника молекул ДНК, используемых в генной инженерии.

1. Первым, важнейшим из них, являются фрагменты генетического материала различных организмов.

2. Вторым источником могут быть двунитевые дезоксирибонуклеиновые кислоты, полученные на основе однонитевой ДНК комплементарной мРНК эукариотических организмов (дн-кДНК).

Подобные копии применяются для экспрессии в бактериях важных с медицинской точки зрения белков человека и животных, таких, как инсулин, ренин, гормон роста и др. В данном случае фрагменты генома нельзя использовать. Это связано с тем, что у эукариот отдельные части некоторых структурных генов разобщены: кодирующие последовательности (экзоны) чередуются с некодирующими вставочными последовательностями (интроны). Ген целиком транскрибируется с образованием первичного транскрипта РНК, затем транскрипты интронов выщепляются, а последовательности соответствующие экзонам, сшиваются с образованием матричной РНК (рис. 2). Этот процесс созревания мРНК называется сплайсингом. Прокариотические организмы не способны осуществлять сплайсинг.

Синтез дн-кДНК достаточно сложен. Этапы синтеза двунитевой кДНК схематически приведены на рис. 3.

3. Третий источник молекул ДНК для клонирования — химический, вернее, химико-ферментативный синтез генов. Иллюстрацией этому является синтез гена лейкоцитарного интерферона человека (более 600 п. о.).

Становление генной инженерии связано с открытием и использованием специального класса ферментов — специфических эндонуклеаз, или рестриктаз. Ферменты этого типа являются составной частью системы рестрикции — модификации прокариотических клеток. Различают три основных класса рестриктаз: I, II и III. Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные нуклеотидные последовательности. Однако рестриктазы класса I осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы классов II и III узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии. Ферменты типов I и III имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей — модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. Ферменты II-го класса состоят из двух отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы. В силу указанных причин в генной инженерии используют исключительно рестриктазы класса II.

Существование системы рестрикции — модификации связано с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК. В норме системы модификации осуществляет метилирование ДНК немедленно после репликации. Важно, что рестриктаза, узнающая тот же сайт, что и соответствующая метилаза, практически не расщепляет ДНК, если хотя бы одна из цепей метилирована. Чужеродная ДНК, попавшая в клетку, атакуется рестриктазой, так как эта ДНК либо не модифицирована, либо модифицирована в системе с другой специфичностью (метилирована, но по другим сайтам).

Большинство рестриктаз класса II узнают на ДНК последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, обладающих осью симметрии второго порядка. В 1973 г. американские исследователи X. Смит и Д. Натане предложили номенклатуру для обозначения ферментов системы рестрикции — модификации. В соответствии с этой номенклатурой, которая сегодня является общепринятой, первая буква рода и две первые буквы вида образуют состоящие из трех букв сокращения источника выделения фермента. Эндонуклеазы обозначают символом R, метилазы — М. Если из одного типа клеток выделены два или больше ферментов рестрикции, то их нумеруют соответственно римскими цифрами. Исходя из этой номенклатуры рестриктазы Е. coli обозначаются как EcoRI, EcoRV и т. д., а рестриктаза из Вас. subtilis Bsul и т. д.

Разрывы цепей ДНК могут осуществляться либо по оси симметрии, и тогда образуются фрагменты с «тупыми» концами (например, рестриктаза Bal I), либо на некотором расстоянии от оси, и тогда образуются фрагменты с выступающими «липкими» однонитевыми 5' (рестриктаза ЕсоRI)-или 3' (рестриктаза PstI)-концами.

Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем один раз через каждые 256 п. о., а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, — через 4096 п. о. Очевидно, что если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при использовании мелкощепящих рестриктаз (узнающих четверки нуклеотидов) и значительна при употреблении крупнощепящих (узнающих шестерки нуклеотидов). Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами либо применяют прием «недорестрикции», т. е. рестрикцию осуществляют в таких условиях, при которых происходит расщепление лишь в одном сайте из нескольких возможных.

Дата добавления: 2015-07-07