Физические и химические мутагены и механизм их действия.

Содержание мутантов в микробной популяции можно резко повысить, если подвергнуть их мутагенезу.

Факторы, вызывающие мутации, относят к разряду физиче­ских, химических или биологических, и называют мутагенами. Мутагены по действию подразделяют на два класса — прямого (на нуклеиновые кислоты) и непрямого, или опосредованного действия (преимущественно - через первичные метаболиты, или белки. В качестве физических мутагенов могут быть повышенная или пониженная температура, различного рода излучения (ультрафи­олетовое, ионизирующее), ультразвук.

При температурном воз­действии на клетки более нестабильными в составе ДНК оказыва­ются пуриновые основания, вследствие чего могут возникнуть апуриновые сайты (выпадение пуринов из ДНК). Так называемый "температурный шок" может приводить к существенным измене­ниям в различных клетках — возрастает частота летальных и видимых мутаций. Очевидно, что воздействие температуры, выхо­дящей за пределы нормальной для данного организма, сильнее отражается на клетках гомойотермных видов (имеющих постоян­ную температуру тела) в сравнении с пойкилотермными видами, температура тела которых зависит от окружающей среды.

Ультрафиолетовые лучи (УФЛ) име­ют большую длину волн, чем ионизиру­ющие излучения, и обладают меньшей энергией. Их мутагенное действие от­крыл А. А. Промптов в 1931 г. УФЛ с длиной волны 260 нм поглощаются ДНК, при этом разрываются водородные свя­зи между комплементарными нитями ДНК и рядом расположенные тиминовые основания образуют ковалентно связанные димеры, останавливающие ее репликацию; ядро теряет способность к деле­нию и клетка погибает.

В мутировавших клетках УФЛ вы­зывают в основном внутригенные пе­рестройки. Мутации, затрагивающие нуклеиновые основания, больше отно­сятся к типу трансверсий. При образовании тиминовых димеров клетки компенсаторно продуци­руют ферменты, комплексующиеся с ними и катализирующие реакции восстановления исходной структуры ДНК. Лишь один фермент, невысвобождающийся из комплекса с ДНК (он здесь неактивен), отделяется в активной форме под действием видимого света (фотореактивация) и затем вновь катализирует реакцию восстановления поврежденной ДНК (фотолиаза + hn ). Следова­тельно, мутагенный эффект УФЛ может быть снят или уменьшен видимым светом. Становится все более очевидным, что УФЛ действуют на разные гены и поэтому сущность такого мута­генеза остается до конца не разрешенной. Более того, известны естественно устойчивые организмы к УФЛ, например, Salmonella typhimurium.

В отличие от УФЛ, излучения типа быстрых электронов, позитронов, протонов, α-частиц, нейтронов, рентгеновских и γ-лучей относятся к ионизирующим, то есть их первичный биологический эффект связан с ионизацией в тканях высших эукариот; вторичный эффект является следствием теплового возбуждения молекул. Косвенный эффект излучений проявляется в возникновении из клеточной воды свободных радикалов, вступающих в реакции с кислородом клеточных структур (образование переки­сей) с органическими молекулами или взаимодействующих между собой. Происходит окисление или передача энергии молекулам ДНК (РНК). Свободнорадикальные процессы могут завершиться дезаминированием и дегидроксилированием оснований, разрывом N-гликозидных связей между основаниями и пентозой, деструк­цией пиримидинов, окислением пентозы, высвобождением пирофосфата. Вот почему различные излучения могут индуцировать самые разнообразные мутации.

Приминительно к ультразвуковым колебаниям (акустические колебания частотой свыше 2*10⁴ Гц) считают, что под их влиянием наблюдаются последовательные изменения вначале в пиримидинах, а затем – в пуринах.

К химическим мутагенам относят: ингибиторы синтеза нукле­иновых кислот, аналоги азотистых оснований, алкилирующие соединения, окислители, восстановители, свободные радикалы, акридиновые красители, некоторые антибиотики. Среди ингибиторов синтеза предше­ственников НК имеются антиметаболиты (азогуанидин, 5-аминоурацил, 6-меркаптопурин, 5-фтордезоксиуридин). Нуклеозиды, со­держащиеся в клетках или добавляемые извне, играют роль анти­мутагенов, снижающих мутагенный эффект названных веществ.

В основе алкилирования НК лежат такие реакции как депуринизация с разрывом сахарно-фосфатной цепи в ДНК; взаимодей­ствие алкилирующих агентов с адениловой, цитидиловой и тимидиловой кислотами с последующей утратой способности алкилированных А, Ц и Т спариваться с комплементарными основаниями; взаимодействие с фосфатными группами НК; взаимодействие двух функциональных групп алкилирующего агента с нуклеофильными группами НК. Представителями алкилирующих мутагенов являются: нитрозогуанидин, этилметансульфонат, акридиновые красители.

К биологическим мутагенам относят вирусы (фаги), живые вакцины, некоторые биотоксины, образуемые грибами, протозоа и гельминтами. Так, изменения в хромосомах вызывают цитомегаловирус, вирус простого герпеса, вирус Сендай, вирус саркомы Роуса и др. Из грибных токсинов — мутагенов ранее был назван афлатоксин В₁. Можно назвать еще треморген, образуемый рядом аспергиллов и др.

Фагоустойчивые мутанты актиномицетов и лактобактерий пред­ставляют интерес для соответствующих производств, например, антибиотиков и молочнокислых продуктов.

Следует отметить, что в живых клетках существуют механизмы исправления (репарации) повреждений ДНК. Процессы репарации связаны с функционированием определенных ферментных систем, контролируемых соответствующими генами. Мутации в этих генах (а также в некоторых генах, ответственных за репликацию ДНК) превращают их в гены-мутаторы, существенно повышающие частоту спонтанных мутаций. Нормальное функционирование систем репарации может сильно снижать эффективность мутагенеза. Известно, например, что в клетках бактерий существуют системы, которые исправляют повреждения ДНК, вызванные алкилирующими соединениями.

Выбор мутагена определяется типом мутации, которую желательно получить (т. е. делеция, замена оснований или сдвиг рамки считывания), а также эффективностью мутагена в отношении данного микроорганизма. Следует отметить, что разные виды микроорганизмов могут требовать разных доз и условий для эффективного мутагенеза.

Простым и удобным методом получения мутантов разного типа является УФ-облучение. Однако высокая частота мутаций достигается здесь при низкой выживаемости клеток. Кроме того, облучение необходимо проводить в условиях, исключающих фотореактивацию. Из химических мутагенов широкое применение в селекционной работе с микроорганизмами получил нитрозогуанидин. Алкилируя основания в точке репликации, где ДНК существует в однонитевой форме, он часто вызывает множественные мутации на ограниченном участке хромосомы (а также в различных районах хромосомы). Множественность мутаций, как правило, является негативным фактором, поскольку наряду с желательными мутациями могут возникать мутации, снижающие жизнеспособность клетки. Однако иногда полезный и стабильный признак может быть получен при одновременном изменении нескольких генов или даже нескольких участков одного и того же гена. Наличие селективных методов позволяет выделять такие мутанты, возникающие обычно с низкой частотой. Применение мутагенов повышает частоту мутантов в 100—1000 раз, что облегчает работу по их выделению методом отпечатков.

Производственные штаммы с высокой продуктивностью крайне нестабильны вследствие того, что многочислен­ные искусственные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности этих клеток положительного значе­ния не имеют. Поэтому мутантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении: популяцию клеток высеивают на твер­дую среду и полученные из отдельных колоний культуры прове­ряют на продуктивность.

Совершенствование биообъектов применительно к производ­ству не исчерпывается только повышением их продуктивности. С экономической точки зрения весьма важно получение мутантов, способных ис­пользовать более дешевые и менее дефицитные питательные сре­ды.

Другой пример: в случае некоторых биообъектов культуральная жидкость после окончания ферментации имеет неблагопри­ятные в технологическом отношении реологические свойства. Поэтому в цехе выделения и очистки целевого продукта, работая с культуральной жидкостью повышенной вязкости, сталкиваются с трудностями при использовании сепараторов, фильтр-прессов и т.д. Мутации, соответствующим образом меняющие метаболизм биообъекта, в значительной мере снимают эти трудности. Большое значение в отношении гарантии надежности произ­водства приобретает получение фагоустойчивых биообъектов. Со­блюдение асептических условий при проведении ферментации прежде всего касается предотвращения попадания в посевной материал (а также в ферментационный аппарат) клеток и спор посторонних бактерий и грибов (в более редких случаях водорос­лей и простейших). Предотвратить проникновение в ферментер фагов вместе с технологическим воздухом, стерилизуемым путем фильтрации, крайне трудно. Поэтому ос­новной путь борьбы с бактериофагами, актинофагами и фагами, поражающими грибы, — получение устойчивых к ним мутантных форм биообъектов.

Не касаясь специальных случаев работы с биообъектами-пато­генами, следует подчеркнуть, что иногда задача совершенствова­ния биообъектов исходит из требований промышленной гигиены. Например, выделенный из природного источника продуцент од­ного из важных беталактамных антибиотиков в значительном ко­личестве образовывал летучие вещества с неприятным запахом гниющих овощей.

Мутации, ведущие к удалению генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе этих летучих веществ, приобрели в дан­ном случае практическое значение для производства.

Из всего изложенного следует, что современный биообъект, используемый в биотехнологической промышленности, — это суперпродуцент, отличающийся от исходного природного штам­ма не по одному, а, как правило, по нескольким показателям.

Дата добавления: 2015-07-07