Традиционные методы селекции

Лекция 2.Совершенствование биообъектов методами мутагенеза, селекции и генной инженерии

Вопросы лекции:

1. Мутагенез и селекция. Вариационные ряды. Классификация мутаций. Отбор спонтанных мутаций.

2. Физические и химические мутагены и механизм их действия.

3. Основные принципы технологии рекомбинантной ДНК. Ферменты, используемые в генетической инженерии.

4. Понятие вектора в генетической инженерии. Методы идентификации и изоляции клонов с рекомбинантной ДНК.

5. Экспрессия чужеродных генов в микроорганизмах.

Мутагенез и селекция. Вариационные ряды. Классификация мутаций. Отбор спонтанных мутаций.

Традиционные методы селекции

Стратегия селекционной работы с организмами заключается в поиске природных форм, которые обладают какими-либо полезными для человека свойствами (синтез ценного соединения, высокая скорость роста, способность к усвоению дешевых и доступных субстратов и пр.), и в последующем их улучшении, создании на их основе промышленных штаммов. Эта задача обычно решается путем изменения регуляции метаболической активности микробной клетки.

Методы современной селекции — это генетическое конструирование, т. е. совокупность приемов, с помощью которых сознательно изменяют генетическую программу организмов.

Генетическое изучение организмов, создавшее фундамент для современной селекции, стало возможным только, когда были разработаны способы выделения клоновых культур, или клонов. Клон — это генетически однородное потомство одной клетки, например колония, возникшая из одной клетки при рассеве культуры на плотной питательной среде. Исследуя свойства такой колонии, можно получить представление и о признаках породившей ее клетки. Клоновая по происхождению культура, наследственная однородность которой поддерживается отбором по специфическим признакам, называется штаммом.

Важно отметить, что при последующих пересевах клоновой культуры (и даже уже в самой колонии) в результате процесса изменчивости могут появиться варианты, отличающиеся от исходного. И тогда клоновая культура клеток превращается в генетически разнородную клеточную популяцию.

По выраженности почти любого признака клетки в микробной популяции составляют вариационный ряд. Большинство клеток имеют среднюю выраженность признака. Отклонения «+» и «-» от среднего значения встречаются в популяции тем реже, чем боль­ше величина отклонения в любую сторону. Первоначаль­ный, самый простой подход к совершенствованию биообъекта заключался в отборе отклонений «+» (предполагая, что именно эти отклонения соответствуют интересам производства). В новом клоне, полученном из клетки с отклонением «+» вновь проводился отбор по тому же принципу. Однако такая про­цедура при ее неоднократном повторении довольно быстро теря­ет эффективность, т.е. отклонения «+» становятся в новых клонах все меньше и меньше по величине.

Важнейшим методом селекции микроорганизмов является отбор мутантов, т. е. организмов с измененными наследственными признаками, которые появляются в результате мутаций.

В самом широком смысле мутацию можно определить как внезапно возникающее наследуемое изменение в генетическом материале клетки. Следует различать мутации цитоплазматические, затрагивающие внехромосомные генетические детерминанты, и ядерные. В свою очередь, ядерные мутации можно разделить на три основных типа: 1) геномные - изменение числа хромосом (полиплоидия); 2) хромосомные - изменение числа и порядка расположения генов (перестройки хромосом или структурные изменения); 3) генные - изменения индивидуальных генов (внутригенные изменения, или мутации в наиболее узком смысле этого слова).

В селекции организмов основное значение имеют последние два типа мутаций.

Хромосомные перестройки включают: выпадения участков хромосомы (делеции), удвоения (дупликации) или умножения (амплификации) числа отдельных генов или группы генов, вставки участков хромосом в новые места (транспозиции), обмен участками между хромосомами (транслокации), изменения порядка расположения генов на хромосоме (инверсии). Такие мутации могут вызывать как утрату функций, так и приобретение новых признаков, в частности в связи со слиянием генов, которые могут оказаться под контролем несвойственных им регуляторных элементов. При этом могут появиться гибридные белки, увеличиться (уменьшиться) количество продуктов определенных генов. За исключением амплификации, все хромосомные перестройки стабильны.

Внутригенные мутации изменяют последовательность оснований ДНК в пределах одного гена. Это могут быть выпадения или вставки одного или нескольких оснований, нарушающие порядок считывания гена в процессе трансляции (frame-shift-мутации, или мутации со сдвигом рамки). В клетках такого типа мутанта синтезируется неактивный белок с измененной последовательностью аминокислот. При транзициях происходит замена какого-либо одного пурина (аденина или гуанина) или пиримидина (тимина или цитозина) на другой пурин или пиримидин соответственно. При трансверсиях пуриновые основания заменяются на одно из двух пиримидиновых и, наоборот, пиримидиновое основание — на одно из двух пуриновых.

Транзиции и трансверсии часто приводят к миссенс-мутациям (мутациям с изменением смысла), поскольку вызывают замену в белке одной аминокислоты на другую. Если кодируемая мутантным геном аминокислота оказывается сходной с той, которая кодировалась геном дикого типа (т. е. исходным родительским геном), то возникает мутантный фенотип лишь с частично нарушенной функцией (leaky-мутант). Часть мутаций с заменой оснований представляет собой нонсенс-мутации (бессмысленные мутации), которые обусловлены появлением кодонов, не кодирующих никакой аминокислоты. В этом случае синтез белка на измененном кодоне прерывается, а образующиеся незавершенные фрагменты белковой молекулы, как правило, функционально неактивны, в частности из-за быстрого их протеолиза. При протяженных делециях, удаляющих значительную часть гена, также синтезируются неактивные фрагменты белковых молекул.

Важной характеристикой мутантов является их способность, к реверсии, т. е. обратному мутированию к исходному фенотипу. Мутанты, которые появляются в результате реверсии, называются ревертантами. При истинных обратных мутациях в ДНК восстанавливается исходная последовательность оснований. Так ревертируют точковые мутации — замены оснований, вставки или выпадения одного или нескольких нуклеотидов.

Кроме того, реверсии могут произойти благодаря супрессорным мутациям. При внутригенной супрессии вторая мутация возникает в том же гене, что и первичная мутация, и приводит к более или менее полному восстановлению функции белка. При внегенной супрессии вторая мутация затрагивает другой ген (ген-супрессор). Так, ошибки кодирования, связанные с нонсенс-мутациями и некоторыми мутациями со сдвигом рамки, могут частично исправляться мутациями в генах, кодирующих тРНК. Восстановленная активность поврежденного белка при этом обычно не превышает 10 % от исходного уровня.

Некоторые внегенные супрессорные мутации могут стимулировать экспрессию мутантных генов, т. е. частично компенсировать дефект поврежденного белка увеличением его количества. Кроме того, может активироваться альтернативный метаболический путь или же изменяться специфичность других белков, которые приобретают способность в большей или меньшей степени выполнять функцию поврежденного или отсутствующего белка Например, у мутантов Е. coli, у которых делеция захватывает весь ген lacZ, кодирующий b-галактозидазу, можно получить ревертанты, приобретающие способность к усвоению лактозы. Оказалось, что при этом изменяется белок — продукт гена, обозначенного ebg, который в результате мутации приобретает способность катализировать расщепление различных b-галактозидов.

Ревертанты, которые возникают в результате внегенных супрессорных мутаций, иногда называют псевдоревертантами. Псевдоревертанты обычно заметно отличаются от исходного родительского типа. Нередко у них изменено множество признаков и снижена жизнеспособность, т. е. супрессорные мутации могут иметь плейотропный эффект.

Как известно, мутации являются первоисточником всех биологических изменений и наряду с процессом переноса генов обусловливают генетическую изменчивость, поставляющую материал для эволюции и искусственного отбора. По своему происхождению мутации бывают спонтанными и индуцированными.

Спонтанные, или неконтролируемые, мутации возникают с низкой частотой. Например, чтобы обнаружить колонию Lac^- (неспособность сбраживать лактозу) среди колоний культуры Е. coli дикого типа (т. е. Lac+), необходимо просмотреть 100 000 клонов. Если есть возможность для отбора редких спонтанных мутантов, то задача упрощается. Можно просто высеять большое количество клеток на среду, где рост исходного штамма невозможен. Так получают мутанты, усваивающие новые субстраты, устойчивые к фагам, антибиотикам и другим ингибиторам метаболизма, а также к физическим агентам (температуре, рН и др.). Ревертанты ауксотрофных (т. е. нуждающихся в питательных добавках) мутантов отбирают на минимальных средах, не содержащих соответствующих факторов роста.

Успех генетико-селекционной работы нередко зависит от создания методов для селективного выделения спонтанных мутантов. Такие методы разрабатываются на основе всестороннего анализа возможных последствий интересующей мутации на клеточный метаболизм и тщательного изучения фенотипа соответствующего мутанта.

Когда невозможно провести прямой отбор мутантов, исследуют колонии на индикаторных чашках, применяют тест-культуры микроорганизмов или перепечатывают колонии на различные среды, т. е. используют метод отпечатков, или реплик. Иногда приходится выращивать каждую колонию и определять в культуральной жидкости интересующую активность.

Индикаторные чашки дают возможность различать мутанты по цвету колоний и проводить тестирование разнообразных фенотипов в больших популяциях. Такие чашки могут содержать среды с индикатором, выявляющим различие в рН между теми колониями, которые метаболизируют определенные углеводы, и теми, которые не обладают такой способностью. Так, на агаре с трифенилтетразолием колонии, не сбраживающие лактозу, приобретают ярко-красный цвет, а колонии, сбраживающие этот дисахарид, остаются неокрашенными. Используются также специально приготовленные субстраты, распадающиеся с образованием красителя при их гидролизе ферментами, наличие которых тестируется на этих чашках. Иногда вносят субстраты, изменяющие прозрачность сред, и наблюдают образование вокруг колоний мутантов зон просветления.

В качестве тест-культур используют ауксотрофы, дающие рост в том случае, если мутанты выделяют в среду искомый метаболит, а также чувствительные культуры, рост которых подавляется, если мутант продуцирует антибиотик. В этом случае по зоне роста или зоне ингибирования роста тест-культуры иногда можно составить представление о продуктивности мутанта. Следует отметить важность изучения морфологии колоний микроорганизмов, которая отражает биохимические особенности образовавших ее клеток. На структуру, форму и прозрачность колоний влияют даже те изменения в биосинтезе, прямая связь которых с компонентами клеточной поверхности не установлена. Так, ауксотрофность и устойчивость к некоторым ингибиторам роста у Е. coll сопровождаются небольшими, но существенными изменениями характера колоний, что помогает распознавать мутанты.

1952 г. Д. Ледерберг и Э. Ледерберг ввели для непрямого отбора мутантов метод отпечатков. Согласно этому методу, чашки Петри засеваются с таким расчетом, чтобы на каждой из них выросло 50—200 колоний. Стерильный бархат или фильтровальную бумагу натягивают на металлический или деревянный цилиндр и закрепляют металлическим кольцом. Чашки с выросшими колониями переворачивают и прикладывают к бархату. Затем к этому же бархату (с отпечатками колоний на нем) прикладывают чистые чашки с различными средами. После соответствующей инкубации на них образуются колонии в том же расположении, что и на исходной (матричной) чашке. Если матричная чашка содержала полноценную среду, то отпечатками на минимальные среды можно выявить ауксотрофные мутанты. Различные модификации этого метода широко используются для выделения мутантов с питательными потребностями, а также мутантов, чувствительных к различным физическим, химическим и биологическим агентам (температура, антибиотики, фаги и др.).

В популяции спорообразующих форм долю ауксотрофных мутантов можно повысить прогреванием культур, прорастающих в минимальной среде. Поскольку чувствительность спор и вегетативных клеток к температуре различна, прорастающие прототрофы при нагревании погибнут, а ауксотрофы, сохраняющиеся в виде спор, выживут и прорастут при переносе их в обогащенную среду.

У мицелиальных грибов для выделения ауксотрофных мутантов используют метод обогащения при фильтрации. Он основан на том, что при культивировании на минимальных средах прототрофные клетки делятся и образуют крупные задерживаемые фильтром частицы, а неделящиеся клетки промываются в фильтрат. Следует добавить, что методы обогащения с помощью пенициллина и фильтрации можно использовать для выделения мутантов, чувствительных к антибиотикам, повышенной температуре и т. д., если действие этих факторов обратимо останавливает рост клеток, но не убивает их.

Ауксотрофные мутанты представляют значительный интерес для селекции промышленных микроорганизмов. Например, используемые в промышленности эффективные продуценты лизина — это гомосериновые ауксотрофы глутаматпродуцирующих коринеподобных бактерий Corynebacterium glutamicum. Мутации ауксотрофности могут повышать выход целевого продукта, изменяя регуляцию его биосинтеза и отсекая побочные пути метаболизма. Распространенный прием получения продуктивных штаммов — это выделение ауксотрофов и отбор псевдоревертантов, несущих регуляторные мутации. Наконец, ауксотрофные мутанты используются при получении рекомбинантных штаммов в генетических скрещиваниях.

К сожалению, методы, повышающие содержание в культуре мутантов, особенно ценных для селекции промышленных штаммов-продуцентов, часто отсутствуют. В этих случаях непрямой отбор спонтанных мутантов становится чрезвычайно трудоемким, так как приходится просматривать десятки и сотни тысяч колоний.

Дата добавления: 2015-07-07