Вектором называется та часть рекомбинантной ДНК, которая обеспечивает ее проникновение и репликацию в клетке-хозяине.

Векторная молекула должна обеспечивать также стабильное наследование гибридных молекул. Для обеспечения интеграции чужеродной ДНК в векторной молекуле необходимо присутствие сайтов расщепления рестриктазами, которые должны локализоваться в области, не существенной для репликации векторной молекулы. Наконец, векторная молекула должна нести хотя бы один генетический маркер, позволяющий фенотипически определить ее присутствие в клетке-хозяине. Очень важно, чтобы вектор позволял осуществлять вставку чужеродной ДНК различной молекулярной массы и чтобы свойства вектора давали возможность различать клоны бактерий, несущих исходные векторные и рекомбинантные молекулы. Удобно работать с небольшими по размеру векторами, которые к тому же дают большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку векторной и рекомбинантной ДНК. Векторная молекула должна иметь как можно больше единичных последовательностей, узнаваемых различными рестриктазами, что может обеспечиваться введением полилинкеров. Лучше всего разработана система вектор — хозяин для бактерий Е. coli. В этом случае используется четыре типа векторов: 1) плазмиды; 2) бактериофаг λ; 3) производные бактериофага λ (космиды и фазмиды); 4) бактериофаг М13.

Плазмиды - представляют собой внехромосомные генетические элементы, которые встречаются во многих видах бактерий. Они существуют обычно в виде ковалентно замкнутых кольцевых суперспиральных молекул ДНК, что является физической особенностью, которая лежит в основе ряда методов очистки плазмид. В качестве векторов используются обычно небольшие плазмиды размером до 15— 20 т. п. о., чаще всего от 2 до 10 т. п. о.

Как правило, репликация плазмидной ДНК осуществляется при участии тех же ферментов, что и дупликация бактериальной хромосомы. Обычно молекулы плазмиды содержат один или несколько генов, которые кодируют белки, регулирующие репликацию. Кроме того, плазмида должна содержать специальный участок инициации репликации, который называется ori.

Различают строгий и нестрогий контроль репликации плазмид. При строгом контроле репликация плазмид сопряжена с репликацией хромосомы хозяина так, что в каждой бактериальной клетке присутствует лишь одна или немного копий плазмиды. Число копий плазмид, находящихся под ослабленным контролем, составляет 10—200. Это число можно увеличить до нескольких тысяч, если подавить синтез белков бактериальной клетки (например, обработав клетки хлорамфениколом). В отсутствие синтеза белка репликация плазмид с ослабленным контролем продолжается, а репликация хромосомной ДНК и плазмид, находящихся под строгим контролем, прекращается.

Для Е. coli создано очень большое число векторных плазмид. Особенно большое распространение получили производные плазмиды ColE1, такие как pBR 322/ Для pBR 322 усталовлена полная нуклеотидная последовательность, что значительно облегчает анализ рекомбинантных молекул. Размер плазмиды — 4362 п.о. Плазмида кодирует устойчивость клеток к ампициллину и тетрациклину, содержит единичные сайты для рестриктаз Aval, BamHI, Clal, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Ndel, Nrul, PstI, Pvul, PvuII, SalGI, Snal, SphI, Fthlll, Xmalll, Ball.

Клонирование в Pstl-сайте инактивирует ген устойчивости к ампициллину, а клонирование в BamHI-, Hindlll-, SalGI- и EcoRV-сайтах инактивирует ген устойчивости к тетрациклину. Таким образом, при трансформации клеток Е. coli смесью молекул ДНК, полученных в результате рекомбинации in vitro при использовании указанных рестриктаз можно фенотипически отличить трансформанты, получившие векторную молекулу (клетки устойчивы к двум антибиотикам), от клеток с рекомбинантными молекулами (устойчивость к одному антибиотику). Этот прием часто используется в генной инженерии и называется инактивацией маркера в результате вставки.

Хотя векторы, несущие два (или более) селектируемых маркера, и позволяют в большинстве случаев отбирать бактерии, содержащие гибридные плазмиды, по инактивации одного из маркеров, однако для этого требуется перенос клонов трансформантов с одной среды на другую методом отпечатков. Это трудоемкая операция, особенно при анализе большого числа клонов. Поэтому в настоящее время сконструированы векторы, позволяющие производить прямой отбор клонов, несущих гибридные молекулы. Для этого в векторную молекулу вводят ген, выражение которого в определенных условиях вызывает гибель клетки. Инактивация этого гена путем интеграции в него чужеродной ДНК делает трансформанты, содержащие гибридные молекулы, жизнеспособными. В качестве генов-киллеров используют kil-гены фага Мu, ген рестриктазы EcoRV, ген синтеза колицина.

Наибольшее распространение для прямого отбора клонов получила другая система на основе известного явления α-комплементации в гене Z lac-оперона. Феномен α-комплементации заключается в том, что NН₂-концевой фрагмент β-галактозидазы размером в 146 аминокислот способен комплементировать определенную мутантную β-галактозидазу бактериальной клетки. Если такой фрагмент вносится в мутантную клетку, то в клетке образуется активная β-галактозидаза и в присутствии индуктора (ИПТГ) и хромогенного субстрата X gal колонии приобретают голубую окраску. Можно поместить в ген lac Z полилинкер для клонирования чужеродной ДНК, не нарушающий α-комплементацию. Если в область полилинкера происходит вставка чужеродной ДНК, то α-комплементация нарушается и клетки, получившие рекомбинантную ДНК, образуют неокрашенные колонии.

Большинство векторных плазмид содержит по одному уникальному сайту узнавания для двух (или более) рестриктирующих ферментов. Введением полилинкера в один из уникальных сайтов можно создать дополнительные участки для распознавания различными рестриктазами. Иногда целесообразно расщепить ДНК-вектор двумя рестриктазами таким образом, чтобы образовались два фрагмента, один из которых не несет никакой важной генетической информации. Далее можно разделить два фрагмента, например электрофорезом, в агарозном геле. Так, при расщеплении плазмиды pBR322 рестриктазами Hind III и BamHI образуется два фрагмента: большой (4,0 т.п.о.) и малый (0,3 т.п.о.). Большой фрагмент можно рассматривать как усовершенствованный вектор. Действительно, из-за того, что концы линейного фрагмента не самокомплементарны (разные рестриктазы), фрагмент не может замкнуться сам на себе, что снижает фон нере-комбинантных молекул. Далее, при расщеплении чужеродной ДНК той же парой рестриктаз фрагменты будут встраиваться только в одной ориентации.

У плазмид на основе репликона ColEI есть и недостатки. Одним из них является снижение числа копий на клетку при увеличении молекулярной массы гибридной плазмиды. Для плазмид этого типа выход рекомбинантов падает с ростом молекулярной массы вставки. Это обстоятельство делает малоэффективным клонирование в плазмидах фрагментов ДНК, превышающих 10 т.п.о. Для клонирования фрагментов большей длины используют фаговые векторы, космиды и фазмиды.

Важным этапом в молекулярном клонировании является процесс введения рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки. Плазмиды вводят в клетки посредством трансформации. Выход трансформантов зависит от штамма Е. соli, размеров ДНК плазмиды, условий проведения эксперимента и колеблется от 10⁵ до 5*10⁸ на 1 мкг интактной ДНК pBR322. В трансформации участвует приблизительно одна из 1000—10 000 молекул ДНК. Низкая эффективность трансформации не является серьезными препятствием при клонировании, особенно при наличии селективных маркеров в векторной плазмиде и в клонируемом фрагменте ДНК, но затрудняет создание клонотек геномов. В последнем случае должны применяться другие системы введения рекомбинантной ДНК в клетку.

Векторы на основе бактериофага λ. Бактериофаг λ — это вирус, размножающийся на бактериях Е. coli. Геном фага λ представлен двуцепочеч-ной ДНК размером в 48,5 т.п.о., которая упакована в головку фага в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами длиной в 12 п.о. (липкие концы). После проникновения в клетку липкие концы объединяются, и ДНК замыкается в кольцо. Кольцевая ДНК является репликативной формой. Возможность создания векторов на основе фага λ связана с тем его свойством, что гены центральной части (от I до N) несущественны для литического развития. Известны способы замещения центральной части фага сегментами бактериальной хромосомы путем определенных генетических манипуляций.

Первые фаговые векторы были созданы уже в 1974 г. Важным методическим приемом, обеспечивающим широкое применение фаговых векторов, явилось открытие способа упаковки ДНК фага в зрелый капсид in vitro. После проведения такой процедуры с рекомбинантной ДНК ее можно вводить в клетку методом инфекции, что намного эффективнее трансформации. При этом методе инфекционной становится каждая десятая молекула ДНК (а не одна из 500—1000, как это в лучшем случае имеет место при трансформации).

Важно то, что в каспид пакуется ДНК определенного размера не выше 53 и не ниже 38 т. п. о. Таким образом, фаговые векторы имеют верхний и нижний пределы размеров клонируемых фрагментов ДНК (рис.). Кроме того, так как фаговые векторы сами являются жизнеспособными фагами, они не могут содержать в геноме ДНК короче 38 т.п.о., хотя гены, необходимые для успешного литического развития, занимают 29 т.п.о.

При использовании фага λ в качестве вектора возникают специальные задачи, связанные с удалением из него «лишних» сайтов рестрикции. Наиболее простые по конструкции фаговые векторы содержат один сайт для крупнощепящей рестриктазы, куда и проводится вставка чужеродного фрагмента ДНК. Такие векторы называют векторами внедрения. Максимальная емкость таких векторов 15,2 т.п.о.

С целью увеличения емкости были сконструированы так называемые векторы замещения. В таких конструкциях между левым и правым плечами фаговой ДНК находится балластный фрагмент, ограниченный сайтами для крупнощепящих рестриктаз. В процессе конструирования рекомбинантных ДНК балластный фрагмент удаляется и замещается на клонируемый фрагмент. Роль балластного фрагмента — сохранение физической величины ДНК фагового вектора, обеспечивающей ее нормальную упаковку в зрелую фаговую частицу. Емкость таких векторов достигают 23—24 т. п. о.

Векторы на основе фага λ особенно удобны для создания клонотек, но мало приспособлены для тонких манипуляций с клонированными фрагментами ДНК.

Дата добавления: 2015-07-07