В обычных полупроводниках радиус экситона Бора (ах) определяет размер областей электронного возбуждения.

Рисунок 29. Дискретные уровни энергии в нанокристаллах. «Сплошной» полупроводник (слева) имеет валентную зону и зону проводимости, разделенные запрещенной зоной E_g. Нанокристалл из полупроводника (справа) характеризуется дискретными уровнями энергии, подобными уровням энергии одиночного атома. В нанокристалле E_g является функцией размера: увеличение размера нанокристалла ведет к уменьшению E_g.

Величина радиуса а_х зависит от силы кулоновского взаимодействия между электроном (e) и дыркой (h). В нанокристаллах же величиной порядка а_х сам размер начинает влиять на конфигурацию пары e – h и, следовательно, на размер экситона. Получается, что в этом случае электронные энергии непосредственно определяются размером нанокристалла - это явление известно как «эффект квантового ограничения». Используя этот эффект, можно регулировать ширину запрещенной зоны нанокристалла (E_g), просто изменяя размер частицы. Сами по себе квантовые точки известны довольно давно, являясь одной из интенсивно развиваемых сегодня форм гетероструктур. Особенностью квантовых точек в форме коллоидных нанокристаллов является то, что каждая точка - это изолированный и мобильный объект, находящийся в растворителе. При ее сшивании с биологически значимой молекулой (например, с антителом) формируется удобный сенсор для цитофлуориметрического анализа. Характерными свойствами подобных сенсоров является следующее:

1. Спектр флуоресценции квантовых точек симметричен и отличается малой полушириной. У органических красителей же характерно наличие длинноволнового «хвоста» в этом спектре, который нередко затрудняет измерения.
2. Спектральное положение максимума полосы фотолюминесценции можно регулировать за счет подбора размера нанокристаллов-квантовых точек, и их состава;
3. Квантовые точки высокоэффективно поглощают излучение в широком спектральном диапазоне. Это позволяет индуцировать фотолюминесценцию разных меток на их базе одним и тем же источником возбуждающего света.
4. Поскольку поперечное сечение поглощения (r) у квантовых частиц велико (поглотить квант может любой электрон полупроводникового нанокристалла), а вероятность излучательных электронных переходов в твердых материалах (т.е. квантовый выход фотолюминесценции q) высока (для нанокристаллов из смеси CdSe/ZnS она составляет около 70%), интенсивность фотолюминесценции таких меток также оказывается очень большой.
5. Квантовые точки почти не подвержены фотохимическому разрушению, что позволяет использовать для возбуждения их фотолюминесценции высокоинтенсивные источники излучения.

Рисунок 30. Свойства квантовых точек из разных материалов. Сверху: Диапазоны фотолюминесценции нанокристаллов, изготовленных из разных материалов. Снизу: квантовые точки из CdSe разных размеров покрывают весь видимый диапазон 460–660 нм. Снизу справа: Схема стабилизированной квантовой точки, где «ядро» покрыто оболочкой из полупроводника и защитным слоем полимера.

Технологии синтеза наночастиц позволяет управлять их формой. Характерная кристаллическая структура конкретного материала (например, для CdSe характерна гексагональная упаковка - вурцит, рис. 30) опосредует «выделенные» направления роста. Можно, например, синтезировать наностержни или тетраподы - нанокристаллы, вытянутые в четырех направлениях (рис. 31).

Рисунок 31. Нанокристаллы из CdSe различной формы. Слева: CdSe/ZnS нанокристаллы сферической формы (квантовые точки); в центре: стержневидной формы (квантовые стержни); справа: в форме тетраподов. (Просвечивающая электронная микроскопия. Метка - 20 нм.)

Полупроводниковые квантовые точки как флуорофорный маркер для биомедицинских исследований не лишены недостатков. Например, в присутствии воды значимо снижается квантовый выход их фотолюминесценции. Это связано с наличием поверхностных «дефектов» в структуре нанокристаллов, в которых происходит безизлучательная рекомбинация возбужденных пар e – h. Для защиты полупроводникового ядра квантовые точки заключают в оболочку, состоящую из нескольких слоев полимерного материала. Это позволяет изолировать пару e – h в ядре, снизить вероятность их безизлучатительной рекомбинации и, следовательно, увеличить квантовый выход фотолюминесценции и фотостабильность наночастицы. В настоящее время наиболее распространенные из флуорофоров-квантовых точек имеют структуру ядро/оболочка (рис. 30). Некоторые из современных флуорофоров на базе квантовых точек из смесей CdSe/ZnS характеризуются величиной квантового выхода фотолюминесценции порядка 90%, что значительно лучше, чем у многих флуоресцирующих красителей.

Рисунок 32. Слева: многоцветное конфокальное флуоресцентное изображение распределения квантовых точек на фоне микроструктуры клеточного цитоскелета и ядра в клетках линии THP-1 (фагоциты человека). Нанокристаллы остаются фотостабильными в клетках в течение как минимум 24 часов и не вызывают нарушений структуры и функции клеток. Справа: накопление нанокристаллов, «сшитых» с пептидом RGD в опухолевой области (стрелка). Правее - контроль, введены нанокристаллы без пептида (CdTe нанокристаллы, 705 нм).

Применение квантовых точек в качестве флуорофоров в медицине и биологии

Свойства квантовых точек (КТ) позволяют использовать их во всех системах флуоресцентного мечения и визуализации биологических объектов. Исключение составляют только флуоресцентные внутриклеточные метки, экспрессируемые генетически - широко известные флуоресцентные белки. КТ можно вводить в объект непосредственно или «пришитыми» к распознающим молекулам (например, антителам или олигонуклеотидам). Проникновение КТ в клетки и их внутриклеточное распределение определяется свойствами примененных нанокристаллов. Например, нанокристаллы разных размеров по-разному проникают сквозь биологические мембраны. Поскольку размер нанокристалла в составе КТ определяет спектр ее флуоресценции, разные области объекта в результате флуоресцируют по-разному (рис. 32). При ковалетном присоединении КТ к распознающим молекулам достигается адресное связывание. Например, используя в качестве распознающих молекул моноклональные антитела против антигенов опухолевых клеток, можно селективно пометить такие клетки флуоресцирующими в заданной спектральной области метками.

Спектральное кодирование и «жидкие микрочипы»

Спектр флуоресценции КТ отличается малой полушириной и симметричностьью. Это позволяет дифференцировать флуоресценцию этих флуорофоров. В настоящее время известны 10 вариантов КТ, спектры флуоресценции которых в видимой области перекрываются слабо, что позволяет легко различать интенсивность фотолюминесценции каждой из них на фоне свечения других КТ. Напротив, спектры поглощения у КТ на базе нанокристаллов характеризуются достаточно большой полушириной полос. Соответственно, это позволяет возбуждать флуоресценцию нескольких разных КТ с разными спектрами фотолюминесценции одним и тем же, единым, источником света. Рассмотренные особенности позволяют применять КТ для так называемого спектрального кодирования, создавая своеобразный «штрих-код» на исследуемом объекте.

В настоящее время часто используется термин «жидкие микрочипы». Этим термином обозначаются системы, к которых отдельные микрообъемы в составе объекта помечаются своей собственной флуоресцентной меткой. Весь набор меток, различающихся как по спектру фотолюминесценции, так и по ее интенсивности, задает, таким образом, набор параметров, кодирующих свойства объекта, т.е. собственно спектральный код. Принцип этого кодирования проиллюстрирован на рис. 33.

Подобный вариант применения КТ очень удобен для проведения ранней диагностики ряда патологий. Например, объект можно обработать моноклональным антителом (или другой распознающей молекулой) с ковалентно присоединённой КТ одного типа, а затем, после удаления несвязавшихся меток – флуоресцентно-меченным другой КТ антителом против данного моноклонального антитела. Признаком наличия в объекте выявляемого антигена (или другого рецептора исходной распознающей молекулы) будет в таком случае наличие флуоресценции сразу двух флуоресцентных меток на базе КТ.

В случае, если изучаемый объект – клетки, получение информации о флуоресценции меток на базе КТ затем удобно проводить «в потоке», методом проточной цитофлуориметрии.

Рисунок 33. Принцип спектрального кодирования. Слева: «обычный» плоский микрочип. Справа: «жидкий микрочип», каждый элемент которого содержит заданные количества КТ определенных цветов. При n уровнях интенсивности флуоресценции и m цветах теоретическое количество кодируемых вариантов равно n^m −1. Так, для 5–6 цветов и 6 уровней интенсивности это будет 10000–40000 вариантов.

Дата добавления: 2015-07-25