Введение генетически модифицированных стволовых клеток в бластоцисты.

Используется зародыш на стадии начала формирования второго зародышевого листка. Клетки взятые из эмбриона можно поддерживать в культуре и их называют эмбриональными стволовыми. Клетки в этот период плюрипотентны, что собственно и нужно. Их подвергают трансфекции различными методами с использованием различных систем. В основном с использованием вирусов. Всегда стараются отобрать те варианты, в которых встройка в определенный участок генома. Векторные молекулы подбирают так, чтобы интеграция не нарушала процессов развития. Поэтому на какой-то момент небыло понятно, куда же лучше вставлять. Для мышей такие сайты известны, в векторах для трансфекции стволовых клеток маркерный ген и ген, который нужно ввести располагают между последовательностями, гомологичными таким сайтам в хромосомах. В качестве маркеров - ген neoR (устойчивость к гемицитину). Это обязательный компонент, отбор считается одним из самых подходящих на среде с гемицитином. Происходит позитивная селекция. Встройки могут идти и в другие участки и в те, которые важды для эмбриона и потомства. Есть еще 2 гена, позволяющие убрать клетки с ненужными вставками - гены тимидин киназы из HSV (Tk1, Tk2). Если встраивание произошло случайно не по гомологичным последовательностям, то в геноме появляется хотя бы один из генов Tk. Если помещать на среду с ганцикловиром, то под воздействием Tk, он превращается в токсическое соединение. Сразу среда с ганцикловиром и G418 (гемицитин).

Если нельзя провести такую селекцию, возможна быстрая проверка клеток с использвованем ПЦР. Для этого - уникальная последовательность в векторе (US). Нигде в геноме ее быть не должно. Использовали разные фрагменты ДНК - либо искусственно синтезируемые, либо бактериальные. Используют конкретные праймеры - один комплементарен этой уникальной последовательности, а второй - тому сайту хромосомы, куда хотели встроить генетическую информацию. Если встройка куда надо, то амплифицируется конкретный по размеру фрагмент.

Если клетки идентифицированы, то потом из вводят в бластоцисты мыши. Затем имплантируют в матку суррогатной матери. Получают чисты трансгенные линии с теми же проблемами. Эмбриональные стволовые клетки используют для получения линий с дефектом по конкретному гену - для идентификации функции гена. Стандартный подход для функционального анализа. Известно более 400 линий. Это позволило идентифицировать ряд генов млекопитающих.

Knock-out - устойчивость к гемицитину внутрь последовательности гена для нокаута, чтобы слева и справа - участи гена. Кроме того, экзоны, сайты полиаденилирования. Вставляется разорванный ген на место исходного. Отбирают варианты, где гомозиготное состояние этого гена и посмотреть, как это влияет на животное - инактивация генов.

На мышах успехи есть. Но иногда нужна экспрессия многих генов, которые нельзя ввести на вирусных векторах. Для некоторых генов необходимо конкретное генетическое окружение - гены продукции иммуноглобулинов. В этом случае вводят YAC. В зиготы - микроинъекция, в эмбриональные стволовые - трансфекция. На этих хромосомах в мышей вводили гены бета-гемоглобина человека. Фрагмент имел длину 250 тпн и содержал 5 функциональных генов для синтеза бета-гемоглобина.

Второй вариант - мыши, способные продуцировать антитела человека. При этом пришлось решать проблему: в мышах есть гены, определяющие продукцию иммуноглобулинов - получили линии у которых нокаутированы свои и введены человеческие. Такие линии содержали кластер генов тяжелых цепей (H-кластер - 4 V, 16 D, 6 J). Вторая вставка - все C гамма и C мю гены. Второй кластер - гены соответствующие легким цепям - 4 V каппа, J, C. Мыши синтезировали человеческие антитела в ответ на введение некоторых антигенов, но разнообразие по специфичности было ограничено. Даже из такой линии были получены гибридомы.

Используя этих мышей получали из них эмбирональные стволовые клетки и методом слияния бакт сферопластов с клетками мыши (в сферопластах - YAC). На искусственной хромсоме (размер - миллион пар) 66 VH генов 30 DH генов 6 JH генов и все гены константных участков цепей мю, дельта и гамма. Была соблюдена последовательность как в лимфоцитах человека. Используя эмбриональные стволовые клетки, ввели отдельно другую искусственную хромосому - 800 тпн. Гены легких цепей 35 V, 6J,

Лекция 18

Получили 2 отдельных линии мышей - одна с тяжелыми цепями, одна с легкими. Далее их скрещивали с линией, где собственные гены иммуноглобулинов нокаутированы и добивались получения чистых линий, не экспрессирующих мышиных иммуноглобулинов. Далее провели аутбридинг чистых линий и были получены мыши, которые в ответ на введение трех сильно различающихся антигенов, на которые вырабатывались чел антитела. Получали мышиные гибридомы.

Дата добавления: 2015-11-16