Читайте также:
|
Изучен был достаточно хорошо. Геном из двунитевой ДНК. Длина 152 тысячи пар. Выражена неронотропность. Жизненный цикл таков, что после проникноввения в клетку репродукция начинается после определенных условий - вирус считается латентным. Вектора на основе - перспективны для генотерапии длительнотекущих нервных заболеваний. В геноме выявлены области, замена которых на чуж ДНК не сказывается на основных этапах репродукции. Но работать с вирусной ДНК сложно из-за больших размеров. Созданы и используются специальная система из 2 компонентов. Первая - колийная плазмида, в которую клонированы 2 участка генома вируса:
Все остальные участки - стандартны (pBR коли). Полилинкер - между участками генома вируса. Второй компонент системы - вирус простого герпеса, в котором нет последовательностей, которые есть в плазмиде. Не может паковаться и репродуцироваться, но кодирует все необходимое для репродукции вирусной ДНК. Для получения вирионов, в которых содержалась бы чужДНК клетки сначала инфицируют вирусом помощником, а затем вводят в них плазмидную ДНК с нужным геном. Репликация вирусной ДНК и ДНК плазмиды происходит по модели катящегося кольца - однонит разрыв в ori к 3' концу - новые нуклеотиды, а вторая - ковал замкнута, служит матрицей. По достижении размера, который соответствует размеру вир генома - отрезание фрагмента, а репликация идет дальше. Параллельно в клетке нарабатываются капсиды, и упаковка нарезанных фрагментов. Идет амплификация. Вся плазмида, в которую вставлен ген - в 10 раз меньше исходного вир генома. Пакуется 10 копий введенного гена. Плазмида носит название ампликона.
Если нет возможности использовать такую систему (нет в распоряжении вируса помощника), чтобы создавать вирусы, нужны пакующие линии клеток. Но возможно получение вектора с конкретным геном по схеме рекомбинации. В этом случае используется плазмида, в которой вводимый ген находится в незначащей области вируса генома (в плазмиде между участками, которые в геноме незначащие). Около 30 тысяч пар. При совместном введении плазмиды и обычного вируса в клетки происходит гомологичная рекомбинации, происходит замена части последовательности вируса. Это неконтролируемая рекомбинация. Не очень велик выход. Более важно, что надо отбирать. (гибридизация, ПЦР), только одна копия гена. Трудно очистить культуру с нужным геном от остатков нормального вируса. Поэтому больше работают с ампликонами.
Все векторные системы на оснвое вирусов потенциально могут быть использованы для генотерапии. Но есть проблемы из-за того, что возможно инфицирование. Поэтому пробовали разные пути введения информации в организм, возможна бомбардировка микрочастицами золота.
Используют и липосомы. Подобранные липидные молекулы с положительным зарядом смешивают с ДНК. Возникают везикулярные структуры - липоплексы. Проходят в клетку хорошо, для клетки такая структура эквивалентна фагосоме, сливается с лизосомами и значительная часть ДНК разрушается лизосомными ферментами.
Использование ДНК конъюгатов - смишивают с полилизином, который связан с белками, специфичными к определенному клеточному рецептору. Полилизин образует везикулярные структуры, внутри которых оказывается ДНК, но поверхность несет белки, комплементарные рецепторам. Стараются присоединить как можно больше белка. В этом случае эффективность поглощения значительно выше, во вторых можно ожидать что будет присоединяться к нужному типу клеток. Оказалось, что образующиеся эндосомы не склонны сливаться с лизосомой.
Введение суспензии молекул ДНК в чистом виде в мышечную ткань. ДНК может попадать в клетки.
При всех этих методах размер молекул может быть любым. Введение искусственных хромосом будет вестись именно так. Искусственные хромосомы разрабатываются - объединение теломер-центромер и Ori. При этом возможно несколько путей для получения микрохромосом.
Пробуют использовать YAC для млекопитающих. В них вводятся некоторые фрагменты хромосом млекопитающих. Введение - микроинъекция, либо электропорацией, либо кальциевой трансфекцией в клетки мышей (эмбриональные стволовые).
Дата добавления: 2015-11-16; просмотров: 55 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Трансгенные растениия как источник мед препаратов | | | Работа над целостным организмом |