Читайте также:
|
Vir область.
8 оперонов в этой области. В октопиновых и нопалиновых эти опероны не одинаковы. Обозначают vir A-H. В нопалиновых Vir f и H, но есть белок Tzs. Данные были получены на плазмидах 15-955 и С58. Все гены в вир области - регулон. Часть оперонов имеют еще и свою регуляцию. Vir A, G - двухкомпонентная регуляторная система. Подобные системы известны у разных бактерий. Считают, что эти 2 белка обеспечивают запуск всего комплекса генов и реагируют они на присутствие веществ, выделяющихся при разрушении растительных клеток (ацетосенгон, конифениловый спирт, феноловая и горчичная кислоты. Все это фенолы растительного происхождения, появляющиеся на этапе синтеза лигнина или суберина). Помимо этих веществ, через эту же сенсорную систему влияют D-галактуроновая и глюкуроновая кислоты (компоненты пектиновых веществ), а также обычные сахара (глюкоза, арабиноза, галактоза). И, наконец, есть реакция системы на рН в кислую сторону.
Сенсорный белок - VirA. Состоит из нескольких доменов. 2 трансмембранных домена. Между ними - периплазматический домен, цитоплазматический домен больше по размерам. Этот домен делится функционально на несколько участков (связующий - линкер, киназный и домен, закрывающий в отсутствие индуктора киназный домен). Обладает аутофосфорилирующей активностью по гистидину. Если появляются индукторы, то фосфатная гурппа переносится с гистидина в VirA на аспартат в белке Vir G. В результате чего последний активируется и может инициировать транскрипцию. Передача сигнала нужна для активации всего регулона за счет взаимодействия VirG с промоторами практически всех генов области.
В оперонах есть Vir боксы. Последовательности из 12 пар нуклеотидов, с которыми связвается VirG в фосфорилированном состоянии. РНК полимераза взаимодействует после связвания VirG с боксом и начинается транскрипция. Для максимально активации оперона необходима мультимеризация или димеризация VirG. Этот белок определяет и свою экспрессию и экспрессию VirA. И первыми при воздействии появляются именно они, чтобы дать максимальный ответ. Количество VirG возрастает при фосфатном голодании и при некоторых воздействиях, так как VirG имеет еще второй промотор.
Лекция 4
2-компонентная сенсорная система. Vir A -тансмембранный сенсорный белок, Vir G - активатор транскрипции. Активация происходит при связывании определенных Vir боксов на промоторах. Для оптимальной активации должен быть фосфорилирован. Фосфорилирование происходит белков Vir A при определенных условиях. Присутствие в раневом соке мономерных углеводов запускает работу Vir регулона, необходим также белок Chv, который кодируется на хромосоме. Он в значительной мере гомологичен белкам энтеробактерий (рибозо- и галактозосвязывающим белкам E. coli). Периплизматический домен Vir А гомологичен белкам системы хемотаксиса E.coli, в частности одному белку из транспорта глюкозы. Комплекс из углевода раневого сока с соответствующим белком так меняет конформацию Vir A, что он способен взаимодействовать с Vir G.
В раневом соке также присутствуют фенольные соединения, которые проявляют защитные свойства. Агробактерии могут реагировать на фенолы через ту же самую 2-компонентную систему. з-й фактор, воспринимаемый через эту систему - pH. Считается, что раневой сок имеет кислую реакцию (ниже 5.5), а при таких занчениях усиливается экспрессия Vir G. Было показано, что усиливается транскрипция со второго промотора, на котором нет Vir боксов (нет регуляции продуктом). Может быть кислая среда является превичным фактором, активирующим Vir систему.
У разных агробактериальных штаммов (на разных Ti плазмидах) Vir G и Vir A несколько различаются. Было показано, что сам белок Vir A также реагирует на изменение pH несколько по-разному. Для каждого из них есть свой уровень pH, при котором он лучше всего воспринимает соответствующие стимулы.
Помимо Chv хромосомных генов вирулентности есть ген Mia A, кодирующий изопентилтрансферазу, который влияет на индукцию vir-оперона. Ген Ros оказывает негативное влияние на индукцию VirC и VirD оперонов.
Считается что в целом самый первый этап индукции vir-оперонов зависит от хромосомных генов. Они не дают высокого уровня экспрессии.
Необходимо чтобы агробактериальные клетки закрепились на поверхности растения. В прикреплении играет роль экзополисахарид beta-1-2-глюкан, выделяемый бактериями. Витронектин - лектиноподобный белок, также играющий роль в пркреплении агробактерии. Негативный герулятор - чем его больше, тем меньше способность клеток прикрепляться. Att белок (3 белка было описано) необходим для прикрепления к мембране растительной клетке после того как бактерии закрепились в целлюлозном матриксе клеточной стенки.
Cel - белок влияет на индукцию синтеза целлюлозы в месте прикрепления (сейчас называется аtt ген)
Ach B - мутации в этом гене приводили к снижению уровня трансформации инфицированных клеток в опухолевые. Предполагается участие в формировании канала, через который передается T-ДНК в клетку.
Vir регулон располагается на плазмидах и включает более 20 генов.
Взаимодйствие белка VirD1 с ДНК Ti плазмиды в районе концевых повторов Т- ДНК. VirD обладает топоизомеразной активностью, при контакте ДНК переходит в релаксированное состояние. Только в релаксированном состоянии Т-ДНК может взаимодействовать с белком VirС1 - он связывается с концевыми повторами Т-ДНК, причем с обоими и способствует точному присоединению VirD2 - он надрезает 2-нитевую молекулу будучи эндонуклеазой, причем правый повтор Т-ДНК имеет более существенное значение чем левый (разрезание обязательно). Полученнная брешь тут же начинает застраиваться, а белок VirD2 остается присоединенным к однонитевому фрагменту, причем для этого присоединения важен Tyr-29 этого белка. Наличие VirD2 защищает фрагмент от деградации экзонуклеазами. Потом VirD2 способствует перемещению ДНК в ядро (как предполагают из-за кариофильной последовательности (NLS) на С-конце белка). Кроме этого в VirD2 есть так называемая omega последовательность - АК замены в этом участке снижают эффективность трансформации растительных клеток, но не ясно на каком этапе эта последовательность работает.
Белок VirE2 - обладает сродством к ssDNA (показано в экспериментах). Защищает ДНК от нуклеаз, ДНК приобретает жесткость. Комплекс ориентируется белком VirD2 по направлению к мембране, поскольку в ходе самого транспорта именно VirD2 важен для контакта с аппаратом, образующим пору в мембране.
Пора формируется параллельно с вышеописанными событиями. Главные белки - virB оперон (B1-B11). Первые эксперименты по делециям в этой области показали что абсолютно необходимы 10 из 11 генов начиная со 2-го. VirB1 считается дополнительным. У всех этих белков обнаруживаются гидрофобные участки и сигнальные последовательности для транспорта в периплазму. Они могут агрегировать образуя олигомеры, что доакзывает их участие в создании трансмембранного канала.
В самой системе ничего принципиально нового нет. Гомология с tra оперонами плазмид с широким кругом хозяев.
Белок VirB7 имеет хорошиий процент гомологии с генами из коллициновых плазмид E.coli, которые ответственны за выведение коллицинов из клетки.
VirD4 белок - по структуре должен быть заякоренным в мембране (на N конце соответствующий домен), но С конец имеет структуру, которая должна локализоваться в периплазме. Считают, что VirD4 способствует правильной ориентации комплекса из Т-ДНК и белков, чтобы он "попал" в канал.
VirF - мутанты по этому белку не утрачивали способность к опухолеобразованию полностью. Менялся круг хозяев.
Большинство экспериментов проводилось на табаке, затем появились опыты с использованием A.thaliana. Пришлось пересмотреть некоторые моменты.
Лекция 6
Гены для утилизации опинов изучались на нопалиновых плазмидах. Изучили гены Nok, которые располагаются возле правого конца Т-ДНК. Транспозоновые мутации при водили к неспособности расти на средах с нопалином или N-орнитином в качестве источника азота. Среди генов катаболизма нопалина есть гены nopC, который отвечает за катаболизм (отсюта C). Ген nopN - отвечает за использование нопалина в качестве источника азота. NopU (uptake) - за транспорт и в этой же области - ген, отвечающий за орнитиновый катаболизм. Гены организованы в оперон и индуктором для этого оперона являются опины - нопалин или близкие к нему.
Сходным образом устроены гены катаболизма октопина на октопииновых плазмидах. Кроме того, на плазмидах есть гены метаболизма аргинина (хотя эти локусы есть на хромосомах). Расположены рядом с генами катаболизма опинов.
Еще одна группа генов - гены, отвечающие за конъюгативный перенос агробактериальных плазмид. Конъюгация у природных штаммов - только между агробактериями или агробактериями и ризобиями. Считается, что гены Tra оперона во всех агробактериальных плазмидах находятся в репрессированном состоянии, но в опухолевых тканях растений имеет место индукция tra оперона. Индукторы генов tra оперона являются опины. Только в опухолях плазмиды дают селективное преимущество - поэтому именно здесь происходит индукция. Если плазмида сохраняется, то интенсивно размножаются те, кто имеет плазмиду, но одновременно осуществляется горизонтальный перенос.
Попадая в опухоль агробактерии распространяют плазмиду. Помимо опинов, влияние на экспрессию генов tra оперона и других оперонов, оказывают вещества, контролирующие плотность популяции. Целый ряд признаков находится под контролем гомосеринлактонов. Часть генов не экспрессируется до тех пор, пока плотность популяции не достигнет определенного уровня. Когда бактерий достаточно много и факторы патогенности могут помочь преодолеть защитные барьеры, то все эти системы активируются. Алгробактерии держат под контролем и передачу генов вирулентности. И vir и tra и опероны, связанные с катаболизмом опинов индуцруются лучше всего, когда количество гомосеринлактона достигает нужного уровня. Промоторы генов синтеза гомосерин лактона регулируются этим веществом, регулируются и другие комплексы генов. То есть для конъюгации необходимы не только опины, но и гомосеринлактон.
Гомосеринлакторны работают в раннем стационаре.
Несовместимость у агробактерий отличается от таковой у энтеробактерий. Октопиновые и нопалиновые - к одной группе несовместимости, но выяснилось, что октопиновые плазмиды по отношению друг к другу не проявляют свойства поверхностного исключения. Несовместимость оценивают по наследованию резидентной или вводимой плазмиды в клетках. Уменьшение числа наследующих определенный репликон клеток - из-за поверхностного исколючнеия. Это ограничение вхождения донорской ДНК. Просто плазмида донора в реципиент не попадает должным образом.
Второй вариант вытеснения - плазмиды в одной клетке, конкуренция за сайты на мембране для репликации. Далее на стабильность наследования может влиять правильность распределения между дочерними клетками. У плазмид с разным типом репликации по разному могут осуществляться распределение копий ДНК между дочерними клетками. Часть белков кодируются генами плазмид, часть - хромосомными генами. Если говорить об агробактериальных плазмид, то скорее всего у них необычный вариант определения совместимости. Октопиновые - по отношению друг к другу не проявляют поверхностного исключения, если есть нопалиновая и в нее вводится октопинова или наоборот, то экспрессия падает на несколько порядков.
Конъюгативные свойства и наследование - гены отвечающие за репликацию - находятся в консервативной области В. Там ori B, и кое что еще. Мутанты с изменением стабильности наследования получены и в бельгии и в голандии и в москве. Исходя из того, что стабильно поддерживаются плазмиды только в агробакт и ризобиях, то им нужны хромосомальные продукты для репликации. Довольно стабильные хромосомальные структуры, мутанты оказалось непросто получить, поэтому мало изучали. Больше интересовали векторные свойства, векторы были стабильны, поэтому интересовались мало.
Т-ДНК именно этот фрагмент переносится в растительную клетку. Это происходит вне зависимости от того, какая это плазмида. Плазмиды A. Rhizogenes тоже имеет плазмиду, и эта область должна быть консервативной. Главные общие черты - наличие повторов по концам этого участка ДНК и присутствие в Т-ДНК генов, определяющих синтез растительной клеткой гормонов роста, и генов определяющих синтез опинов. Общая черта - все эти гены имеют эукариотические промоторы. Когда были получены первые сведения о них, предположили их эукариотическое происхождение. Пытались искать гомологические участки в клетках растений. Но высокой степени гомологии обнаружить не удалось.
Т-ДНК встраивается в геном как единая целостная структура, это продемонстрировали на подсолнечнике в Бельгии. Но чаще, выявляется в виде двух независимо втраивающихся фрагментов. T-l и T-r левая и правая. Оказалось, что правая часть в геноме опухолевых клеток присутствует в большем количестве копий, чем левая. В ней - контроль синтеза опинов, гены контролирующие гормоны роста - в меньшем количестве. В этих же работах обнаружили ситуации, когда в опухолевых клетках не было T-r фрагментов, и в них не синтезировались опины. Для нопалиновых плазмид такого разделения не показано - встраивается как целый фрагмент.
Есть различие октопиновых и нопалиновых по протяженности: у нопалиновых - 15 Мда, у октопиновых - 11МДа. Внутри каждой группы может быть незначительное различие. Когда сделали сиквенс, то обнаружили нечто похожее на инсерционные последовательности эукариот. Высказывали мысль по поводу того, что бактерии получили этот материал от растений, но потом в эту область встраивались эукариотические последовательности. Отобрались такие формы, где функция Т-ДНК не была нарушена. Правая часть Т-ДНК более важны для эффективной трансформации растительных клеток. Понимание этого обеспечило создание более эффективных векторов.
В отношении транскрипции генов Т-ДНК, выяснили, что регуляция есть, но не понятна. Должна осуществляться клетками растений. Ингибирование образования побегов - SHI. Мутация в определенном участке Т-ДНК сказывается так, что лснижается способность образования побегов. Подобный фенотип TNS - по морфологическим измененеиям в опухолях. Еще одна группа мутантов - ROI (ингибирование образования корней). В отношении генов продукции опинов, их достаточно быстро клонировали, определили последовательность нуклеотидов, при изучении промоторных областей этих генов вяснили, что промотор гена нопалинсинтетазы является мощным. Во многих конструкциях, которые в дальнейшем получались в ходе генноинженерных работ, именно этот промотор использовался. Промотор работающий в эукариотической клетке, под него ставят гены, которые необходимо экспрессировать в растениях. Пытались выяснить, чем обеспечивается встраивание Т-ДНК в ДНК растительной клетки. Нужно подчеркнуть, что встраивается всегда в ядерную (не обнаруживается ни в пластидной ни в митохондриальной). Необходимо, чтобы повторы по концам были не нарушены (25 пн). Для передачи Т-ДНК в растительную клетку, необходим правый повтор, но есть мнение, что левый повтор (сам повтор) должен оставаться интактным. Предпочтительных сайтов встраивания не обнаружено - считают, что это случайное встраивание. Предположили, что Т-ДНК подобна транспозонам прокариот, которые не имеют преимущественных сайтов встраиваиня. Абсолютного сходства между Т-ДНК и мигрирующими элементами прокариот или эукариот нет. Нет генов, ответственных за перенос из одного участка генома в другой (подобного транспозазам, резолвазам). Кроме того, при интеграции Т-ДНК ее концевые повторы не передаются в интактном состоянии. Кроме того, при встраивании мобильных элементов, обнаруживаются повторы из "хозяйской" ДНК, в случае Т-ДНК этого нет.
Нашли сходство с фагом лямбда. Примыкая к левому повтору, есть 8 нуклеотидов, совпадающих с определенным участком фага лямбда - chi сайтом. В фаге есть короткие концевые повторы по 15 пар, которые известны как att сайты. Эксцизия лямбда из бакт хромосомы и интеграция в нее зависит от этих повторов и они - сигналы для сайт-специфической рекомбинации. Высказывалась мысль, что у лямбда chi сайт нужен для запуска Rec ABC зависимой рекомбинации. Высказывалась мысль, что в растительной клетке - рекомбинация с участием этого участка.
Возможность введения новой генетической информации в бактериальные, дрожжевые клетки, подобрали условия для трансформации клеток. Агробактерии с их плазмидами и Т-ДНК оказались эффективным генноинженерным инструментом потому, что обеспечивают введение в растительную клетку, имеющую твердую оболочку, генетической информации естественным для агробактерий путем.
Вектор должен обеспечивать стабильное наследование, высокий уровень экспрессии и должен иметь гены, обеспечивающие тестирование наличия этих генов в клетках трансформированного организма. В зависимости от уровня организации организма эти общие требования конкретизируются и есть разница между векторами для получения трансгенных про и эукариот (растений и животных).
Лекция 7
Вектора. Продолжим....
В 80-х годах была написана книга о векторах для растений. Определенные качества векторов (из нее):
- ДНК должна быть пригодна для молекулярного клонирования, желательно иметь специфические векторы (уникальный сайт для введения ДНК). В настоящее время - полилинкеры.
- Вектор должен быть способен к переносу в клетки выбранного для трансформации организма любым из методов (хотя бы одним).
- Вектор должен обеспечивать репликацию (желательно в большом числе копий) введенного чужеродного фрагмента.
- Вектор должен обеспечивать эксперссию чужеродных генов
- Вектор должен обеспечивать стабильное наследование чужеродного фрагмента.
- присутствие векторной молекулы и непосредственно чужеродного фрагмента в трансформированных клетках должно легко тестироваться.
- Вектор не должен вызывать патологического состояния трансформированного растения.
- Вектор не должен препятствовать превращению индивидуальной растительной клетки в целостное растение (не должен мешать регенерации).
- Чужеродный ген должен стабильно передаваться потомкам при любом способе размножения.
- Вектор должен обеспечивать поддержание и экспрессию любых генов вне зависимости от их происхождения.
- Желательно чтобы вектор имет максимально широкий круг растений-хозяев и обязательно включал основные сельскохозяйственные культуры.
Агробактерии: Все представители класса двудольных трансформируются естественным способом. С применением особых техник это можно утверждать и для однодольных. В ряде случав можно обойтись без протопластирования (трансформация с клеточной стенкой). Т-ДНК способна транскрибироваться в растительной клетке.
В 80-х годах анализировали как распределяются копии Т-ДНК в геноме с помощью Саузерн-блоттинга.
В бельгии пробовали оценить наследование фермента лизопиндегидрогеназы, встроенного в Т-ДНК. Поставили под эукариотический промотор и следили за потомками. Все вегетативные потомки несли этот признак (табак). При семенном размножении если трансген был мужским растением, то 50% проростков образовывали фермент. Если трансген был женским растением, то только 43% проростков образовывали фермент. Гибриды самоопыления давали 71% лизопиндегидрогеназы. Это дало основание утверждать, что наследование идет по менделевской схеме.
Емкость Т-ДНК может быть большой, вполне приемлемой для работы. На модельных фрагментах ДНК показали что 50 кb легко встраивается. Наличие только концевых повторов и участков, прилегающих к ним все равно обеспечивало нормальное встраивание в хромосому.
Плазмиды дикого типа имеют недостатки:
- сама по себе Ti-плазмида большая, на ней трудно проводить генетические манипуляции.
- если брать исходную Т-ДНК и встраивать в нее что-нибудь, то получается больное растение, что не есть хорошо.
- сама Т-ДНК не имеет хороших селективных маркеров
Основная задача - переделать Ti-плазмиду, чтобы она соответствовала требованиям к векторам. Делалось это комплексно, в различных лабораториях.
Клонировали Т-ДНК в векторы, существовашие для работы с E.coli, решив проблему дальнейших манипуляций (pBR322, pRK290). Далее отбирали делеционные варианты Т-ДНК в которых бы отсутствовали гены опухолеобразования или опинов. Были получены варианты со вставкой полилинкеров в то, что осталось от Т-ДНК. После отбирали варианты уже с чужеродными вставками. Мобилизация векторной молекулы с помощью плазмиды-помощника (конъюгация) - перенос в агробактерии. После совмещения в клетке таких плазмид и обычных Ti-плазмид использовали такую культуру агробактерий для трансформации растительных клеток. Часть клеток трансформировалась в опухолевые, но маркеры отсутствовали (встранивание Т-ДНК). Иногда получались варианты клеток с маркером. Пришли к выводу, что в агробактериях возможна рекомбинация между векторами. Сначала для отбора рекомбинантных Ti-плазмид использовали либо элиминацию промежуточного вектора либо чего-то еще. Поскольку необходимая рекомбинация происходит только при двойном кроссинговере, попытались создать систему, в которой одиночный кроссинговре давал такой же результат. Впервые получилось в 1983 году. Заменили все onc гены на фрагмент pBR322. Вектор получил название pGV3850. В результате исходная плазмида лишается онкогенности, а при совмещении такой плазмиды с промежуточной плазмидой на основе pBR322 в результате одного акта кроссинговера вся промежуточная плазмида встраивается в Т-ДНК. Результаты были подтверждены ректрикционным анализом. Можно брать для введения любую pBR322, в которой есть нужные гены, нет необходимости предварительно встраивать в pBR322 Т-ДНК.
Похожую плазмиду сделали в 1985 году. pTi В6S3, для октопиновой плазмиды. Удалили всю Т-ДНК и заменили ее на фрагмент из pBR322. Этот вариант получил название pGV2260. Параллельно была сконструирована pGV831, pBR325, содержащая ген стрептомицинрезистентности и ген канамицинрезистентности с промотором нопалинсинтетазы. Здесь же был участок с сайтом для BamHI (уникальный) и концевые повторы с обоих сторон из Т-ДНК октопиновой плазмиды.
Совмещение pGV2260 с pBR322 с нужным геном приводит к образованию коинтеграта, который несет все необходимое.
Челночные вектора. Вектор-самоубийца должен нести легко селектируемый маркер, по "спасению" маркера отбирали те клетки, в которых рекомбинация произошла.
Все рекомбинационные события происходят в агробактериях, механизмы не сильно изучены. Поэтому решили проводить все рекомбинационные события в E.coli. Подобрали T i-плазмиды, стабильно поддерживающиеся в колийных клетках. На них и проводили все манипуляции. Выигрыш состоит в том, что можно использовать любые вектора, поддерживающиеся в E.coli, не нужно вводить промежуточный вектор в агробактерии, что экономит время и не только. Трансформация в E.coli происходит легко в отличие от агробактерий. Процент рекомбинации намного выше, чем у агробактерий. Обратно в агробактерии перенос осуществлялся хорошо идущей конъюгацией.
SEV. Вектор со слипающимися концами. Такая система широко использовалась (114 лабораторий) и включала в себя промежуточный вектор pMON200 (9.500 bp)(сделана из pBR322 (1.6 bp - репликация в коли, локус для мобилизации при конъюгации с агробактериями (bom) (2.2 bp - правая граница нопалиновой ДНК и гены нопалинсинтаз), гены устойчивости к пектиномицину и стрептомицину из Р1, ген устойчивости к канамицину (из Tn5) с промоторами нопалинсинтетазы и кусок Т-ДНК октопиновой плазмиды А6 (LIH) - участок гомологии и плазмидой помощником). pMON200 хорошо поллерживается в колях, хорошо переносится в агробактерии, отбирается по стрептомицину. LIH обеспечивает объединение с плазмидой-помощником, причем встаивание происходит таким образом, чтобы вся конструкцияя была в составе Т-ДНК. Помощник получен из октопиновой плазмиды путем удаления из нее всей правой части (T-r) и около 80% левой части (T-l). На место удаленной последовательности ввели последовательность из Tn903 - есть устойчивость к канамицину с эукариотическим промотором. Название плазмиды-помощника - pTiB6S3-SE. Не может давать онкогенность, кусок Т-ДНК никаих изменений в растительных клетках не вызывает. Канамицинрезистентность позволяет следить за присутствием плазмиды в процессе получения рекомбинантных молекул. Кроссиноговер происходит в высокой эффективность. pMON200 полностью встраивается в Т-ДНК.
Лекция 8
С применением pMON200 и плазмиды помощника проводили трехродительские скрещивания. Использовались несколько доноров. Первый донор - e.coli с плазмидой pRK2013, которая способна обеспечить перенос тех репликонов, которые имеют соответствующий сайт мобилизации (pMON200 имеет такой сайт). Такой донор смешивают с e.coli с pMON200 с клонируемым геном. Затем смешивают с культурой агробактерий, в которой присутствуют плазмида-помощник и Ti плазмида pTi B6S3-SE. Культура агробактерий рузистентна к хлорамфениколу за счет мутации в хромомсомных генах. Все высевается на среду, содержащую хлорамфеникол, чтобу убрать обоих доноров и стрептомицин и канамицин для селекции получающихся коинтегратов. При такой интеграции получаются варианты Т-ДНК в обоими концевыми повторами и геном, который должен вводиться в растение. Очень удобный вариант введения.
Такие системы называются системами с промежуточными векторами, так как предполагают объединение в одном репликоне Т-ДНК и генов, обеспечивающих перенос ДНК в растительную клетку (в cis положении). Есть 1 недостаток - для трансформации конкретного вида растения нужно создавать такие конструкции de novo. У агробактерий существует хозяйская специфичность, поэтому иногда исползовать PTiB6S3-SE не было возможности. Поскольку vir гены и Т-ДНК могут эффективно взаимодействовать через свои продукты и в trans положении, это начали использовать для инфицирования растительных клеток. Такие системы называются бинарными системами векторов. Первые работы начались в Голландии и США.
Бинарные веторные системы конструируются на основе плазмид с широким кругом хозяев (репликон должен стабильно поддерживаться в агробактериях). Наиболее часто используемый репликон pRK2 (pRP1 или pRP4). Для подобных целей стараются минимизировать этот репликон (ставляют oriV, несколько генов, необходимых для репликации и соответствующий участок tra оперона, обеспечивающий конъюгативность). Дополнительно в репликон введены фрагменты из агробактериальных плазмид (концевые повторы Т-ДНК, между ними ген неомицинфосфотрансферазы-2 под промотором нопалинсинтетазы и полилинкер). Наиболее известны из бинарных векторов следующие - pBin19 (репликон pRK2 полилинкер из pUC19, ген канамицинрезистентности с прокариотическим промотором для отбора агробактерий с этой плазмидой. Недостаток - малая копийность в e.coli), ее затем модифицировали - ввели сайты инициации репликации, повысив копийность. Такая плазмида получила название pGA471, потом сделан ее улучшенный вариант (добавили cos-сайт для использования ее в качестве фазмиды). Маркерами являются канамицин- и тетрациклинрезистентность. pMON505 - pMON200, который объединили с репликоном pRK2. Такой вариант вполне приемлем и широко использовался.
Для работы с бинарными векторами необходимы плазмиды-помощники. Поначалу пытались использовать природные плазмиды аробактерии без изменений, но затем в большинстве лаб все-таки изменяли природные плазмиды с сохранением хозяйской специфичности, но вырезанной Т-ДНК. Хуй (это Хаминец написал).
Как плазмиды-помощники изпользовали pIGV3850, pTiB6S3-SE, улучшенный вариант предыдущей плазмиды pTiB6S3-NE (Т-ДНК вырезана полностью), плазмида на основе агробактериальной pTi Ach5 - ввели транспозон Tn904 (устойчивость к стрептомицину) в результате чего образовался делеционный вариант без Т-ДНК.
Практически во всех случаях когда системы отрабатывали самое главное было подобрать условия для наиболее точного и эффективноо введения генетического материала. К настоящему времени нашли наиболее удачные репортерные гены и селективные маркеры для агробактериальных систем. Некоторые из них - неомицинфосфотрансфераза, гигромицинфофотрансфераза, стрептомицинфосфотрансфераза, гентамицин-ацетилтрансфераза, хлорамфеникол-ацетилтрансфераза и так далее.
Металлотионеин II- белок млекопитающих, способный связывать потенциально опасные ионы металлов, количество его существенно возрастает при контакте клеток с тяжелыми металлами (наличие регуляторного элемента возле сайта инициации транскрипции). Промотор гена регуляторного элемента из клеток млекопитающих - пиздатая штука. Классический пример - ген гормона роста мышам ставили под этот промотор и поили водой с тяжелыми металлами.
Широко применять гены устойчивости к АБ нежелательно, так как есть опасения, что из растений такие гены могут распространяться в популяции патогенных для растений МО. В лабораторных исследованиях такие гены используются вовсю, но перед выпуском на поля предлагается их заменять. На практике одни и те же сорта растений подвергают нескольким этапам генетических манипуляций - несколько целевых генов (были получены сорта кукурузы устойчивые к нескольким вредителям). Перед каждой новой манипуляцией необходимо заменять репортерный селективный ген.
Были получены варианты где ген используемый для селекции или как репортерный вводили в сочетании с фрагментами мигрирующих элементов либо растительных геномов либо элементов, сотвествующих бактериальных транспозонов. Идея такова - вводится конструкция с нужным геном и маркером, затем благодаря мигрирующим элементам селективный ген отделяется от гена, несущего нужный признак. Затем отбирают варианты где нужный ген остается на месте, а селективный маркер исчезает (получается на практике).
Помимо агробактериальных систем параллельно разрабатывают векторные системы на основе вирусов растений. Эффективность этого направления достаточно низкая. Основные посылки для использования вирусов были следующие:
- при инфицировании растительных клеток вирусами в клетке на определенных этапах появляется значительное количество копий вирусной нуклеиновой кислоты, а следовательно создаются предпосылки для сверхэкспресси генетической информации. (Количество копиий аробактерий не так уж велико). Проблема в том, что большинство из изученных вирусов растений - РНК-содежащие и их использование ограничено. ДНК-содержащие вирусы растений пытались использовать. Каулимовирусы. Группа из более чем 10 близкородственных вирусов. Типовым является вирус мозаики цветной капусты (CaMV). Поражает прежде всего представителей семейства крестоцветных - рапс, турнепс, арабидопсис. Можно заражать представителей семейства пасленовые. Симптомы болезни, вызываемой CaMV достаточно похожи, в основном проявления хлоротических повреждений на листьях. В природе растения заражеются через повреждения, которые создают насекомые-вредители, в основном тли. В эксперименте при нанесении суспензии вирусных частиц на механические повреждения листовых пластинок заражение происходит со 100% эффективностью, но в природе как считают для того, чтобы растение системно "поразилось" необходимо определенное сочетание условий, поэтому эти вирусные заболевания не являются широко распространенными. Факт распростанения вируса по всему растению считается положительным. Локализуется вирус в клетке в виде белково-нуклеиновых комплексов, известных как тельца включения. В пораженной клетке появляются оформленные белковые гранулы, причем поверхность телец включения - специфические вирусные белки, а центральная часть - сформировавшиеся вирусные частицы. Несмотря на то, что зрелые частицы локализуются в цитоплазме, основные этапы репродукции осуществляются в ядре. Первоначально это уалось покаазать по выявлению специфических вирусных ДНК в ядерной фракции путем гибридизации. ДНК вируса из зрелых вирусных частиц состоит из кольцевых молекул, отличающихся от таковых прокариот. Они не являются суперскрученными (релаксированны) и такое кольцо не является ковалентно замкнутым. Удерживается молекула в кольцевой форме за счет водородных связей, возникающих между азотистыми основаниями на концах (они комплементарно перекрываются в определенном районе и при выделении ДНК почти всегда получаются и линейные фрагменты). Когда сравнивали структуру ДНК из близкородственных вирусов оказалось есть некотрые различия по длине прерывистостей, но общий принцип строения сохраняется. Когда анализировали ДНК из ядер (до формирования зрелых частиц), то в ней не оказалось тех прерывистостей - она ковалентно замкнутая суперскрученная ДНК, в большинстве случаев выделялась в комплексе с белками растительного происхождения. Такую стадию называют стадией минихромосомы, подчеркивая, что вирусная ДНК чем-то напоминает эукариотическую хромосому и в это время она является транскрипционно активной. Удалось показать, что транскрипция ДНК этого вируса осуществляется по часовой стрелке и способна транскрибироваться только - нить (она же alpha). Комплементарная ей beta нить не транскрибируется. Процесс транскрипции осуществляется с помощью РНК-поимеразы II (показано с помощью alpha-аманитина). В alpha нити располагаются 6 больших и 2 малые рамки считывания. Между 6 и 7 рамками находится межгеномная область длиной 700 bp. В 2-х других местах есть еще 2 маленькие межгенные области - 60 и 100 bp. В эти места и необходимо вставлять генетическую информацию, так как это не нарушит функции самого вируса. Продукты транскрипции анализировали и оказалось, что их может быть 4 типа (типичные эукариотические продукты). Подавляющее большинство - 35S РНК и 19S РНК. Показано, что вторая соответствует открытой рамке считывания 6, а первая - результат транскрипции полного вирусного генома при старте с ORF 6. Промотор, обеспечивающий транскрипцию 35S РНК самый мощный - его и используют для создания векторных систем.
Лекция 10
Наиболее широко используемый метод - агробактериальное введение нужных генов, но разрабатываются методы прямого введения ДНК. В отличие от бактериальных клеток и клеток животных применять просто трансформацию сложно из-за плотной клеточной стенки - серьезное перпятствие для проникновения ДНК. Когда получили протопласты, начали пытаться вводить ДНК.
С 60 года первая работа по получению стабильных протопластов. В ней применили смесь пекто и целлюлаз грибного происхождения и это достаточно эффективно. В работах на протопластах выяснили, что существенным препятсвтием для введения ДНК явялются нуклеазы в растительных клетках. В первых экспериментах по трансформации - крайне низкие частоты. Стали искать хим агенты, которые могли бы с одной стороны уменьшить нуклеазную активность, а с другой стороны модифицировать поверхность протопластов. При обработке ПЭГ или полиLорнитином, частота повышается на несколько порядков. А если после обработки этими веществами клетки выдержать в среде с высокой концентарцией кальция, то это повышает частоту трансформации. Кроме этого, буферы с рН 10 оказываются более пригодны, чем остальные. рН в данном случае снижает активность внутриклеточных нуклеаз. Кроме этого, присутствие в таких растворах ионов цинка оказывается эффективными в экспериментах, где все эти факторы объеденены вместе достигалисьь самые высокие частоты трансформации.
В конце 70 начале 80 широкое использоваание получили агробакт клетки, попытались объединить их с методами прямой трансформации. Появился метод кокультивации. Здесь исходят из того, что агробактерии наиболее эффективно взаимодействуют с клетками, которые восстанавливают клеточную стенку. Ткань в месте раневого поражения - наиболее эффективное взаимодействие. Попытались создать условие in vitro, чтобы растительные клетки находились на стадии восстановления стенки. Действиетельно, при помещении протопластов в условия, способстсующие регенерации, то процесс, продолжающийся около 2 суток, способствует взаимодействию с агробактериальными клетками. Если протопласты поместить в среду с невысоким содеражнием растительных гормонов и выдерживать в темноте 24 часа, то затем при перемещении такой суспензии в условия освещения, начинаются этапы сосстановления клеточной стенки и именно в этот момент добавление агробактерий в такую суспензию оказывается наиболее эффективным. Оптимальное соотношение бактериальных и растительных - 400-500 бактериальных на оодну растительную. Путем микроскопирования проанализировали образуемые комплексы между бактериальными и растительными клетками, показали, что на недостроенной клеточной стенке растительной клетки появляется максимально много сайтов закрепления агробактериальных клеток. По мере восстановления возникает то оптимальное обрастание элементами стенки бактерильных клеток, которое необходимо для введния Т-ДНК. Добавляли ингибиторы регенерации клеточной стенки и частота трансформации снижалась на 3-4 порядка.
Период кокультивации 32 часа, после ччего отмывают от избытка бактерилаьных клеток, либо высевают всю суспензию на среды для культивирования растительных клеток но в такой среде есть антибиотик, действующий на бактерильные клетки (пенециллиновый ряд). В этом случае все бактерилаьные клетки должны погибнуть, а развиваться дальше - трансформированные бакт клетки.
Есть вариант использования ярастительных протопластов и сферопластов бактерий. Этот подход отрабатывали для трансформации однодольных растений (в силу особенностей их клеточных стенок). Если создать условия, в которых поддерживаются протопласты раст клеток и сферопласты бактерий, оказалось, что сферопласты агробактерий, коли, ризобиум могут быть исспользованы в таких экспериментах, причем (показали микроскопированием) должно происходить слияние раст протопластов и сферопластов бактирий. В условиях, где содержатся агенты для слияния мембран (ПЭГ). Необходимо добиваться высоких значений рН (11) и создавать повышенные концентрации ионов кальция и цинка. Успехи были получены в конце 80 годов. Использовали при этом сферопласты коли. Для двудольных - частоты 3 на 10 в -1, для двудольных - чуть пониже.
Метод микроинъекции растворов ДНК в растельные клетки. Такой методы пытались применить к растительным клткам в 60 годах, но на целых клетках это не удавалось, потом когда стали исопльзовать протопласты, затруднение в том, что их трудно иммобилизовать - они плохо прикрепляются к стеклу. Стали применять полилизин, который достаточно эффективен и немного модифицировали методику поулчения самих протопластов, считая, что сохранение некоторых компонентов стенки способствует закреплению. Метод трудоемок, нужны микроманипуляторы, все это делается медленно, но можно вводить ДНК куда надо (в ядро растительных клеток). Оказалось, что введение буферов с концентрацией от 0,1 до 1 мкг на мл достаточно для того, чтобы информация была интегрирована. Объем ратвора до 5 пиколитров. Хотя количетво обработанных клеток невелико, выход трансформантов 25-50%. Пригоден для трансоформации плохо трансофрмируемых другими методами клеток. Наиболее успешны такие подходы, когда используется конструкции, сделанные на основе Т-ДНК, или на основе вируса мозаики цветной капусты. Когда агробактерии вводят Т-ДНК, то она попадает в коплексе с белками, которы направляют в ядро, защищают. При микроинъекции вводят без белков, и эффективность остается высокой. Объясняется тем, что в ядре нуклеопротеидный комплекс освобождается от белков и происходит рекомбинация. В ядре ДНК расщепляется в меньшей степени, чем в цитоплазме. Но метод очень трудоемок, и применяется когда другие методы не работают.
Воздействие электрического тока - электропорация. Все началось с метода электрослияния (циммерман в 1974), тогда продолжались работы по объединению целых протопластов для получения стабильных гибридов. Подбирали условия для направленного слияния клеток разных видов - использовали микрокамеры, если через буфер пропускать электрический ток, то клетки, имея заряженные поверхности располагаются определенным образом, выстраиваются в цепочку между электродами, при воздействии переменного тока в 100В, визуально (микроскопированием) контролировали правильность выстраивания, а затем 50 мсек - импульс постоянного тока. Продукты слияния двух геномов крайне нестабильны, из всех этих опытов вяснили, что можно исопльзовать воздействие тока для более эффективного введения ДНК из растворов в протопластированные растительные клетки, подобрали методики, позволяющие делать это эффективно.
Есть особенности электропорации растильеных клеток. Оптимальными стараются подобрать условия для уменьшения электрического шока.
Пробовали вводить ДНК, РНК, различные размеры - оказалось, что ввести можно почти все, но наиболее эффективны Т-ДНК или мозаика цветной капусты.
Помимо такого введения, есть метод введения с помощью липосом. Заимствован из методик для животных клеток. Применим оказался и для растенний. ДНК заранее упаковывается в фосфолипидные везикулы, которые возникают при суспендировании в водно-солевых растворах определенных фосфолипидов, и далее такми везикулами обрабатывают протопласты растительных клеток. Путем микроскопирвоания покаазали, что протопласты способны осуществлять эндоцитоз таких липосом или можно добиваться слияния этих везикул с протопластами добавляя ПЭГ или поливинилацетат. Существенно, что эффективен этот метод тогда, когда протопластирование растительных клеток проведено с максимальной эффективностью. Остатки растительных клеток резко снижают эффективность введения с помощью липосом. Протопласты должны быть абсолютно голыми. Считается, что введение с помощью липосом имеет преимущества перед просто введением ДНК, поскольку меньшее количество клеток гибнет (в тех условиях, в которых вводят ДНК). Поступающая ДНК внутри липосом меньше подвергается нуклеазной деградации, но чтобы шла эффективная интеграция в геном необходимо освобожение ДНК из липосомы (процессинг липосомы внутри растительной клетки, как он осуществляется, в деталях неизвестно). В мембранных везикулах пытались вводить отдельные хромосомы в другие клетки, и анализировали их поведение.
Помимо манипуляций на изолированных клетках, есть методы, которые применяются не столь широко. Макроинъекция ДНК в отдельыне части растений. В завязи некоторых растений вводили растворы ДНК. Получая клетки из них, оценивали, какая часть несет новую информацию.
Замачивание зародышей семян однодольных в растворах с высокой концентрацией ДНК. ДНК в таких условиях может проникать в отдельные клетки, но трансформантов не было. Дополнили воздействием тока, зародыши в раствор, и по сути форез ДНК, что якобы способствует проникновению.
Введение в пыльцу. Специльно подготовленные пыльцевые зерна. ДНК может проникать при определенных условиях.
Бомбардировка. Частицы золота или вольфрама до 0,1 мкм, они покрываются ДНК, для чего используют хлорид кальция, спермидин, ПЭГ, и затем частицы разгоряются до 600 м в сек. Если ткань поместить в поток таких частиц, то они проникают через стенку и обнаруживаются в ядрах. Берутся разные фрагменты тканей: меристемы, зародыши, клетки зародышей, незрелые зиготические зародыши, пыльца, каллусы.
Большинство работ сделано при помощи агробактерий.
Проблема выбора генов в генетической инженерии
Пытались совмещать в различных комбинациях гены пластид и хромосом. Но введение информации по фотосинтезу резко дестабилизовало весь процесс. Не получены улучшенные растения.
В отношении азотфиксации, полезна мысль о возможности исопльзования генов фзотфиксаторов, заставило более подрбно изучать азотфиксацию. Оказалось, что у всех азотфиксаторов системы азотфиксации сложны но и продукты генов, имеющих отношение к фиксации азота должны функционировать в строго определенных условиях, создаваемых клеткой. Даже в самых простых случаях (клебсиелла) 17 генов для собстввенно фиксации и около 20 для создания условий гены подвержены жесткой и не полностью изученной регуляции. И упорядоченность выражения генов определяет возможность фиксации азотой. Перетащить такой блок генов может и можно, но создать условия практически невозможно. Подход по расширению круга хозяев азотфиксаторов тоже оказались не плодотворными. Только бобовые вступают в контакт с ризобиями. Тогда начали активно изучать процесс симбиоза, стало известно о sim плазмидах. Найти особенности в генетическом аппарате бобовых, обеспечивающих контакт не удалось до сих пор.
Успешно решили задачу по устойчивости к гербицидам. Накопление гербицидов в таких концентрациях, что они ограничивали рост сельскохозяйственных растений. Часть земель даже вывели из использования. Гербициды условно можно разделить на 3 группы по характеру воздействия:
Эти гербициды вводились постепенно и большая часть - подобрана эмпирически в середине 20 века. А потом изучали характер действия на растение. Те, кто хотел получить устойчивые растения использовали несколько подходов. Один заключался в том, чтобы получить мутантные варианты растений, которые бы утратили чувствительность к гербициду и попытаться использовать гены, которые у таких растений изменились. Второе направление - создать генноинженерными путями толерантность к гербициду и достичь ее можно тремя путями:
Для реализации этих подходов нужна информация о генах, связанных с действием гербицида и устойчивостью к нему. В отношении гербицидов 1 класса, он действует так: атрозин присоединяется к мембранам тилакоидов и блокирует транспорт электронов к белку Qбета. Этот белок кодируется хлоропластным геном. Ген был изолирован - psb A. И оказалось, что у мутантных сорняков, устойчивых к атрозину этот белок отличается всего одной аминокислотной заменой серина на глицин в 228 положении. Но этого достаточно, чтобы Qбета переставал быть мишень. Позже обнаружили еще мутанты, где были заменены другие аминокислоты. Такие замены приводили к снижению основной активности белка. Эти сорняки росли хуже. Ген был отклонирован, поставлен под промотор нопалинсинтетазы и объединен с последовательностью транзитного пептида из гена rbcS (малая субъединица рибулозо-бисфосфат-карбоксилазы). Сделали на табаке и первым, кто получил устойчивые растения - Фалько и соавторы.
Лекция 11
Устойчивость к гербицидам.
Источником мутантных генов к этим гербицидам могут быть цианобактерии и одноклеточные эукариоты - Chlamidomonas reincardi. Устойчивые варианты - путем отбора на средах с гербицидами. Такие гены с эукариотическими промоторами вводились в растения.
Устойчивость к гербицидам второй группы (глифосат), создана путем введения соответствующих генов. Это производные глицина. Широко применялся, действует как ингибитор синтеза аромат аминокислот. Мишень - 5-енолпирувил-3-фосфатсинтетаза (EPSP). Ген в ядре. Обнаружить сорные устойчивые растения - не удалось. Чувствительны не только растения, но и бактерии, что и было использовано. Удалось получить бактерии с высоким уровнем устойчивости. Бактериальные мутанты были двух типов. Одна группа - сверхпродукция фермента. Использовать их как источник резистентности - невозможно. Во второй группе - мутанты по самому ферменту (ara A мутанты), имели фермент, который не связывал гербицид.
ДНК мутантных генов объединяли с ДНК, кодирующей транзитный пептит рубиско гороха. Этот химерный ген вводили в промежуточный вектор в клетках коли. И затем передавали эту конструкцию в агробактерию с плазмидой pGV3850 (плазмида для работы с коинтегратами - вырезана часть Т-ДНК, вставлен кусок pBR - для рекомбинации). Сначала делали на табаке, а затем получили и трансгены. Устойчивость получили в качестве пробного эксперимента во многих лабораториях.
Устойчивость к глифосату может возникать и при цитоплазматической локализации мутантного гена.
Для получения трансгенов, устойчивых к гербицидам третей группы (хлорсульфурон, сульфометуронметил) - тот же подход. Эти гербициды широко используются. Они действуют на изофермент 2 ацетолактатсинтетазы - Als II. Это фермент нужный для биосинтеза изолейцина и валина - первый фермент биосинтеза разветвленных аминокислот. У растений гены кодирующие этот фермент имеют ядерную локализацию. Но продукт имеет транзитный пептид и транспортируется в хлоропласты. У микробов есть путь биосинтеза этих аминокислот, то мутантов получали и из бактерий и из дрожжей (пекарских). Ген был клонирован из S. typhimurium и с эукариот промотором введен в растительные клетки, устойчивость проявлялась. С дрожжами оказалось неудачными. Удалось получить устойчивые растительные клетки в культуре - табака и арабидопсиса. Из растений стали брать гены устойчивости и переносить их в сельскохозяйственные растения.
Все эти примеры - реализация линии, направленной на изменение мишени для гербицида. Велись работы по внедрению способности разрушать гербицид. В начале 90 были получены такие растения, устойчивые к биалофосу - природный гербицид, который получают из актиномицетов: Streptomyces viridochromogenes и еще один - продуценты. Сам гербицид - трипептид из двух L-аланина и одного остатка фосфинатрицина (аналог глутамата, является действующим компонентом). Фосфинотрицин высвобождается под действием протеаз и необратимо инактивирует фермент в ассимиляции аммония - глутаминсинтетазу, из-за этого растение погибает. Источник резистентности - сами продуценты. Предположили наличие механизм защиты у S. hygroscorpicus обранужили ген, кодирующий фосфинотрицинацетилтрансферазу (PAT). Под воздействием этого фермента фосфинотрицин превращается в нетоксичный продукт, который не связывается с глутаминсинтетазой. Этот ген поставили под промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, с другой стороны от гена bar добавили сигналы полиаденилирования и терминации транскрипции одного из генов октопиновой агробактериальной плазмиды. Потом химерный ген объединили с маркерным геном неомицинфосфотрансферазы и поставили под промотор нопалинсинтетазы, все это ввели в pGV1500. вводили в растения, сначала на табаке, затем получили картофель, томаты, рапс, сахарный тростник. Использование таких растений предохраняет почвы от загрязнения гербицидом. Причем происходит очищение ранее загрязненных виалофосом почв.
Дата добавления: 2015-11-16; просмотров: 50 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Organization of the Cell | | | Получение растений, устойчивых к насекомым-вредителям |