Трансгенные растениия как источник мед препаратов

Пионерские работы - Чарльз Арнцен (хьюстон, техасский университет). Удалось показать, что ген поверхностного белка вируса гепатита В можно эксперссирвоать в клетках табака и белок из табака дает такой же иммунный ответ, как и из вирусных частиц. Можно получать вакцинные препараты из растительного материала. Есть проблемы - очистка требует особых подходов. Часть веществ, которые попадают в препарат - гликозиды и т.д. Сам факт, что для получения вакцины можно не использовать патогены, все должен окупить.

Еще одно направление - можно создавать гибридные вирусы, которые несут часть генома растительных вирусов и часть генома вируса человека. Работу сделали совместно англичане и американцы: получили вирус мозаики коровьего гороха, в составе которого были фрагменты gp40 ВИЧ. Таким вирусом заражали растения, его выделяли, вводили в организм белых мышей - появлялись антитела, связывающие ВИЧ. В отношении же противобактериальных вакцин, все ссылаются на работу Арнцена. Использовали ген термолабильного энтеротоксина энтеропатогенных колей. Этот токсин близок к холерному. Эти коли выхывают холероподобное заболевание. Токсин состоит из одной субъединицы А, массой 27 кДа, и 5 одинаковых субъединиц В. Массой 11,6 кДа. На лабораторных животных показано, что иммунитет определяется выработкой антител к субъединице В. Она нужна для присоединения к клеткам кишечника и не токсична. При взаимодействии с ней антител, А не попадает в клетки и не повреждает. Решили выбрать малую субъединицу - лабильный токсин В (LTB). Конструирвоание векторных молекул проходило следующим образом:

Фрагмент, состоящий из промотора 35S РНК ВМЦК и примыкающая к нему справа 5 концевая последовательность вируса гравировки табака, далее полилинкер и 3' концевая последовательность гена вспб из сои (сайт терминации и полиаденилирвоания). Это ввели в pUC19 - получили pIBT210. затем с помощью ПЦР синтезировали фрагмент длиной 67 пар нуклеотидов, который отличался от сайта иницации трансляции гена LT-B наличием сайта для рестриктазы NcoI. По этому сайту pIBT210 вставляли ген. Паралельно с этим в плазмиде pJC217 ввели искусственную последовательность - она определяет накопление белка в ЭПР эукариот (SEKDEL) - pLTK217. вырезали из нее кодирующие области генов LT-B и SEKDEL и переклонировали в рbluescript. Оттуда все это перенесли в pIBT210, полученную на первом этапе. Получили pLTB200 и pLTK200. далее из них вырезали структурные части и вставляли в pLTB5 так получили pLTB210 и pLTK 210. далее это перенесли в векторы для агробактериальной трансформации. Только после всего этого ввели это в клетки табака и клетки картофеля. Отбирали по антибиотикорезистентности, ввырастили растения. Определили количество LT-B в листьях табака и клубнях картофеля. На основе связывания с белка с ганглиозидом. Оказалось, что конкретные трансформанты проявляли различный уровень экспрессии, но если в трансформантах, несущих только ген LT-B только 5 мкг на 1г белка, то с SEKDEL - 14мкг. В картофеле - в целом тот же результат. 30 мкг в клубнях, с sekdel - 110мкг. Это оправдало введение этой последовательности, и накопление в ЭПР защищает от протеолиза. Белки очистили и ввели в кровь лаб животных с целью создания иммунитета к эшерихиозу, и это иммунитет возник и более того, когда мышей кормили сырыми клубнями - у них возникал иммунитет.

При варке белок денатурирует. Дальнейшая работа должна была быть перенесена на те, которые можно есть сырыми. В странах третьего мира - колоссальная детская смертность до года из-за этих болезней.

Лекция 15

Почему насекомые. Базируется на методах поддержания клеток насекомых в культуре и изученности бакуловирусов. Это ДНК вирусы - достоинство. Они нашли применение в качестве объектов используемых для биологического контроля численности насекомых-вредителей в лесном и сельском хозяйстве. Изучили механизм их репродукции, чтобы их больше нарабатывать. Вирион попадает в клетки эпителия кишечника, транспортируется в ядро и дам раздевается. В ядре происходит репликация ДНК вируса и начинается экспрессия генов, кодирующие белки вирионов и генов, продукты которых обеспечивают образование новых вирусных частиц. Небольшая часть вновь образовавшихся вирионов отшнуровывается от клетки и гемолимфой разностистя по организму насекомого, но большая часть вирионов остается внутри этой клетки и образует компактную структуру, имеющую стенку из белка, который называется полиэдрин. Внутри этой структуры - неактивный вариант вируса. Но в это время активные варианты проходят такой же путь. Образуются скопления вирусов в полиэдриновых оболочках. Длится это 5-7 дней, после чего насекомое погибает. В среднем 10 раундов репликации осуществляется в каждой инфицированной клетке, в теле насекомого доля полиэдриновых частиц - 25% от сухой массы. Эти комплексы после разрушения клеток насекомого не разрушаются и длительное время сохраняются в среде, пока не попадут в другой организм. После съедания, полиэдрин расщепляется протеазами, и вирус высвобождается. ДНК была клонирована в последней четверти 20 века, определены функции основных генов и было установлено, что цикл развития вируса не нарушается, если из генома удалить структурный ген полиэдрина. Промотор гена полиэдрина очень сильный, конститутивный. Это - основание для экспрессии вводимых генов.

Больше всего работают на конкретном бакуловирусе, который называется вирусом множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV - multiple nuclear poliedrosis virus). Этот вирус поражает более 30 видов насекомых и лучше чем другие репродуцируется в культуре. В качестве источника клеток - совка люцерны (Spodoptera lagiperda) поражает 80 видов растений. Вирус выделили в 70 году.

Векторы для введения генетической информации - стандартная плазмида коли на основе pBR322. Ap res, ori и встроены фрагменты ДНК AcMNPV - последовательность, предшедствующая 5' концу гена полиэдрина и имеющую достаточную для рекомбинации протяженность; промоторная область полиэдрина - Pp; полилинкер; сайт терминации транскрипции и полиаденилирования из этого же гена Pt; дальше кусок ДНК из вируса - второй сайт рекомбинации с ДНК вируса. Все манипуляции в коле, здесь же наработка ДНК для трансфекции.

Любое введение ДНК в животные клетки - трансфекция (трансформация - для раковых клеток). Трансфекции подвергают клетки, несущие вирус. Происходит двойной кроссинговер между введенной плазмидой и вирусной ДНК. Исходный ген полиэдрина заменяется на чужеродный. Из-за отсутствия полиэдрина - большинство вирионов инфекциозны, и на газоне клеток - зоны лизиса. Из них выделяют рекомб штамм вируса. (без полиэдрина - лизис, то есть есть вставка, оттуда берут вирус). Зоны лизиса бывают маленькими. Есть улучшенные конструкции, несущие маркерные гены. Наиболее распространенный вариант - lacZ, зоны репродукции вируса окрашиваются в синий цвет. Экспрессия маркерных генов идет с промоторов, которые активны в течение всей репродукции. При использования для экспрессии белка промотора полиэдрина, время наработки белков - 5 суток. На 2000 год экспрессировано и полученов чистом виде более 500 белков. Часть молекул белка, синтезирующихся на поздних стадиях литического цикла не успевают подвергаться пост-трансляционным изменениям. Кроме этого, выяснилось, что линейная ДНК вируса гораздо хуже вызывает инфекционный процесс. Провели улучшение системы бакуловирусных векторов. Наиболее удачным оказался вариант вируса, в который ввели уникальный сайт для рестриктазы Bsu 361. в клетке насеокмых вводили вирусную ДНК после обработки этой рестриктазой. Репродукция происходила лишь в некоторых клетках, где случайно вирусная ДНК закольцовывалась. Но оказалось, что если с линеаризованной ДНК вводить кольцевой вектор, и в нем есть сайты для рекомбинации, то в результате - резко увеличивается количество кольцевых молекул, и значит больше бляшек.

Эффективность отбора рекомбинанта при применении такой схемы повысилась с 1 до 30%. Эта система была улучшена за счет введения еще одного сайта для Bsu. В ген, который участвует в репликации. При этом 2 сайта - слева и справа от гена полиэдрина, при рекомбинации ген заменяется на нужный кусок. Но в этом случае пришлось переделать pBR - ввели последовательность ORF16-29 и ORF603. В этом случае выход рекомбинантов 99%. Во всех этих случаях включение чужеродного фрагмента в ДНК бакуловирусов - в клетках насекомых, поэтому бывают сбои. Создали систему для рекомбинации в коле.

Бакмиды

Все рекомб события в коле. Используется конструкция, в которой 5'конец полиэдрина, lacZ, att сайт, который обеспечивает встраивание в lacZ. Ген устойчивости к канамицину, ori для коли и 3' конец гена полиэдрина. В клетках насекомого получили рекомбинантную ДНК, включающей весь геном вируса и эту конструкцию. Так получили бакмиды, если эту ДНК брать из клеток животных, и вводить в колю, то там поддерживается весь геном вируса. Для интеграции в состав бакмиды нужного гена используются вспомогательные плазмиды, которых две. Одна из них несет ген устойчивости к ампицилину и ген, который нужно перебросить в бакмиду. Есть правый фрагмент, обеспечивающий встраивание при транспозиции и левый. Там же ген устойчивости к гентамицину (во встраивомом фрагменте). Стандартно - промотор, полилинкер, терминатор. Вторая плазмида - устойчивость к тетрациклину и ген транспозазы.

Если нужно вводить ген, то его вставляют в донорную плазмиду. Такую плазмиду смешивают с ДНК второй вспомогательной плазмиды и трансформируют штамм коли, в котором находится бакмида. После трансформации высевают на среду с канамицином, гентамицином ИПТГ, X-gal. Колонии с нужной вставкой - белые. Проверяют клоны на ампицилин и тетрациклин устойчивость, отбирают чувствительные (не содержащие вспомогательных плазмид). Эти клоны ростят на среде с гентамицином и гентамицином. Идет транспозиция (не рекомбинации).

Одна из проблем работы с клетками животных, продуцирующих белки - выделение белка. На насекомых отработаны подходы для улучшения очистки белков. Применили фрагменты ДНК, которые кодируют короткие АК последовательности, необходимые для аффинного связывания при хроматографии на колонках. Один из вариантов - гексагистидин (His6). Последовательность стоит сразу же за промотором и за ней спейсерный участок - пространство. Белок с такой надстройкой при пропускании гомогената клеток через колонку с никель-агарозой задерживается на сорбенте. Затем колонку промывают раствором имидазола, который имея более высокое сродство к никелю, вытесняет белок и после этого полученную фракцию обрабатывают специфической протеазой. Иногда надстройку не удаляют, если белок не используется в мед целях и это не мешает функциональной активности белка.

Полседовательность для связывания с глутатионом, тогда он содержится в колонке. Еще одна метка - последовательность из мальтозо-связывающего белка. И поседовательности, узнаваемые моноклональными антителами.

В качестве сайтов протеолиза - разные последовательность. Они высокоспецифичны и чтобы небыло для в белке - сайт для тромбина и энтерокиназы.

Переходят на клетки насекомых, если другие методы дают низкий выход белка. Получают белки вирусов человека и животных. Антиген вируса синего языка (болезнь коров). Нарабатывают антиген вируса... Типа 1, белок ВИЧ 1, капсидный белок вируса простого герпеса, гемагглютинин гриппа, белок вируса Ласса, белки полиовирусов, гликопротеин бешенства, гликопротеин 50 псевдобешенества и антиген ротавируса обезьян. Установили, что в дрожжах не могут модифицироваться, и системы модификации - только в клетках животных.

Кроме этих экспрессирован один из белков малярийного плазмодия и один из белков сибирской язвы. Сообщается, что можно нарабатывать белок человека, который имеет отношение к наследственным патологиям - регулятор проницаемости мембран (муковисцидоз). Можно нарабатывать аденозиндезаминазу человека. Липаза поджелудочной железы человека. Щелочная фосфотаза - замедленный рост у детей. Нарабатывают альфа и бета интерферноны, интерлейкин 2 и гемопоэтины.

Мышиные моноклональные антитела, ДНК-полимеразу человека (альфа) и в последнее время для изучения белков с неизвестной функцией. Ряд рецепторов удалось идентифицировать после экспрессии в клетках насекомых.

Лекция 16

Помимо работы с клетками насекомых, работают с клетками млекопитающих. Есть белки, которые нормальными в других системах не получаются. Векторы для введения новой генетической информации в клетки млекопитающих разрабатываются по общему принципу: те же векторы из коли, второй же компонент - маркер, обеспечивающий отбор трансфецированных клеток млекопитающих. В качестве маркера - ген неомицинфосфотрансферазы из транспозонов бактерий под промоторами животных. Этот ген оказалось возможным использовать, поскольку генецитин (G-418), к которому клетки чувствительны, а фосфотрансфераза его инактивирует.

Следующий маркер - дигидрофолат редуктаза (DHFR), разрушает метотрексат. Этот ген изначально в клетках есть, нужно использовать дефицитные по этому гену клеточные линии. Уровень устойчивости зависит от числа копий гена. И повышая концентрацию метатрексата в среде, можно отобрать клетки с наибольшим количеством копий. Третий маркерный ген - глутаминсинтетаза. Избавляет от аммиака ткани и органы. Всегда есть в клетках млекопитающих, но при попадании в клетки некоторых производных аминокислот активность этого фермента недостаточна для их обезвреживания. Одно из таких веществ метионин-сульфоксимин. Если клетки выращивать на среде с ним, то вырастают только те, у которых - сверхэкспрессия глутаминсинтетазы.

Последний фрагмент векторов - участок, обеспечивающий репликацию и стабильное наследование в клетках животных. Все эти фрагменты вирусного происхождения. Используются ретровирусы, вирусы простого герпеса, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы.

Дата добавления: 2015-11-16