Валидационная оценка методик титриметрического и

спектрофотометрического анализа в тесте «Количественное определение» по показателю линейность

Цель работы: научиться проводить валидационную оценку методик количественного определения по показателю линейность.

ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЛОК

Линейность методики – это наличие прямой пропорциональной зависимости аналитического сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе.

Линейность выражается уравнением у = ax + b. Это уравнение называют линейной регрессией. Параметр b градуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициент a характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики.

Расчет коэффициентов градуировочного графика проводят по формулам и данным таблицы 6:

В химических методах анализа (титриметрия) аналитик не может повлиять на значения коэффициентов a и b. Однако, если при проведении контрольного опыта, титрант не расходуется, то градуировочный график принимает форму прямой, выходящей из начала координат, и имеющей тангенс угла наклона равный 1.

Значения параметров a и b вычисляются методом регрессионного анализа. В настоящее время пользуются соответствующими компьютерными программами (например, Excel).

Основной характеристикой линейности является коэффициент корреляции — мера взаимосвязи измеренных явлений. Коэффициент корреляции (обозначается «r») рассчитывается по специальной формуле:

Для аналитических целей можно использовать только ту методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с коэффициентом r, который должен быть ≥0,99.

Пример. Зависимость оптической плотности от концентрации для продукта взаимодействия рутина с алюминия хлоридом. В ходе выполнения исследований были получены результаты, построен градуировочный график (рис. 1).

Рис. 1 - Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации рутина

Как следует из представленного графика, все экспериментальные точки находятся вблизи линии тренда (прямой линии), а величина коэффициента b незначительная. Поэтому составляется таблица (см. табл. 2) и вычисляется коэффициент корреляции. Результаты расчёта представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Пример вычисления коэффициента корреляции

xi	yi	xi∙ yi	xi^2	yi^2
0,0005	0,119	0,000059	0,00000023	0,0142
0,0010	0,241	0,000241	0,00000100	0,0581
0,0015	0,367	0,000551	0,00000225	0,1347
0,0020	0,483	0,000966	0,00000400	0,2332
0,0025	0,604	0,001510	0,00000620	0,3648
0,0030	0,726	0,002178	0,00000900	0,5271
0,0035	0,839	0,002937	0,00001220	0,7039
0,0040	0,964	0,003856	0,00001600	0,9293
∑=0,0180	∑=4,344	∑=0,01229	∑=0,000051	∑=2,9653

Для данной выборки значение коэффициента корреляции составило 0,9999. Это позволяет утверждать о наличии достаточно жёсткой линейной зависимости оптической плотности от концентрации.

Самостоятельная работа студентов

Для проверки линейности следует брать не менее 5 экспериментальных точек. При этом наиболее правильно использовать отдельные навески и затем готовить из них растворы соответствующих концентраций.

На характер градуировочного графика и на линейность в значительной степени могут оказывать влияние условия выполнения анализа: количество реактивов, концентрации анализируемых растворов и др.

Полученные данные следует представлять в виде градуировочного графика с линией тренда, уравнения графика и величины коэффициента корреляции.

Задание 1. Изучить методику определения линейности количественного определения одного из ингредиентов лекарственного средства титриметрическим или спектрофотометрическим методами.

Задание 2. Провести определение линейности количественного определения одного из компонентов титриметрическим методом в модельной смеси 1. Для этого проводят 5-6 определений ингредиента в навесках с разными массами. Рассчитайте массу навесок лекарственного средства, чтобы на титрование было израсходовано не менее 1 мл и не более 20 мл титрованного раствора.

Проведите титрование и заполните таблицу 3.

Таблица 3 – Данные для построения градуировочного графика при использовании титриметрического метода

Навеска (г или мл)	Объем титранта, мл

По результатам испытаний постройте градуировочный график зависимости объема титранта от навески. Рассчитайте уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции.

Задание 3. Проведите определение линейности методики количественного анализа ингредиента спектрофотометрическим методом.

Постройте градуировочный график согласно методике. Измерьте значение оптической плотности каждого раствора, результаты занесите в таблицу 4.

Таблица 4 – Результаты измерения оптической плотности

Концентрация (г/мл или %)	Оптическая плотность

По полученным данным постройте градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации. Рассчитайте уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции.

Задание 4. Сделайте заключение о линейности методик титриметрического и спектрофотометрического определения ингредиентов лекарственного средства.

2.4. Валидационная оценка методик титриметрического анализа по показателю «Правильность»

Цель работы: научиться оценивать методики титриметрического анализа по показателю «Правильность».

ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЛОК

Правильностью аналитической методики называется степень близости экспериментальных результатов к истинному значению во всей области измерений. Главным фактором, определяющим правильность, является значение систематической погрешности.

Для оценки правильности методик количественного определения субстанции применимы следующие подходы:

a) применение аналитической методики к образцу с известной степенью чистоты, например к стандартному образцу;

b) сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой методики и арбитражного метода, правильность и прецизионность которого известны;

c) заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Для оценки правильности методик количественного определения активного компонента в готовом лекарственном препарате применимы следующие подходы:

a) применение методики к искусственным (модельным) смесям, к которым были добавлены известные количества анализируемого вещества;

b) если невозможно получить образцы всех компонентов лекарственного препарата, возможно применение метода добавок или арбитражной методики, правильность которой доказана;

Далее приведен первый способ определения правильности с использованием модельной смеси.

Для тестирования методики на правильность готовятся три модельные смеси из разных навесок с точным содержанием каждого из компонентов, включая и вспомогательные вещества. Согласно рекомендациям ICH необходимо проанализировать не менее 9 образцов на 3 уровнях концентраций. Правильность методики устанавливается в указанном диапазоне ее применения. Для оценки полученных результатов наиболее простым и наглядным критерием служит открываемость (R), которая вычисляется по формуле:

При проведении анализа будут получены 9 значений открываемости.

Для более детальной оценки следует статистически обработать полученные значения R, рассчитав стандартное и относительное стандартное отклонения. Это наиболее простой способ (способ А).

Далее вычисляют величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD):

Например, валидационной оценке была подвергнута методика количественного определения метронидазола в инфузионном растворе методом непосредственной спектрофотометрии. Полученные результаты установления правильности представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты установления правильности методики с использованием открываемости

№	Уровень	Взято метронидазола, г/100 мл	Найдено метронидазола, г/100 мл	R,%	Метрологические характеристики
		0,2506	0,2509	100,12	SD=1,027   RSD=1,038%
		0,2509	0,2512	100,12
		0,2511	0,2505	99,76
		0,5066	0,5011	98,91
		0,5121	0,5122	100,02
		0,4998	0,5000	100,04
		0,7511	0,7509	99,97
		0,7321	0,7328	100,09
		0,7459	0,7457	99,97

Для того чтобы сделать вывод о полученных результатах, следует иметь ввиду, что для анализа субстанций с содержанием действующего вещества не менее 98%, значения правильности должны быть в пределах 99-101%. При анализе субстанций с нормой содержания действующего вещества менее 98%, в пределах 98-102%. Для лекарственных препаратов с различным содержанием определяемого компонента рекомендуются следующие интервалы правильности (таблица №6):

Таблица 6 – Оценка правильности в зависимости от концентрации активного компонента в анализируемом образце

Содержание аналита в образце, %	Открываемость, %
	98 – 102
≥10	98 – 102
≥1	97 – 103
≥0,1	95 – 105
0,01	90 – 107
0,001	80 – 110
0,0001	80 – 110
0,00001	60 – 115
0,000001	40 – 120

Оценку правильности методики следует проводить по коэффициенту Стьюдента по формуле:

.

По ГФ XII рассчитанное значение коэффициента Стьюдента не должно быть более 2,31.

Самостоятельная работа студентов

Задание 1. Изучите методику определения правильности титриметрическим методом.

Задание 2. Проведите анализ девяти образцов компонента модельной смеси определяемого титриметрическим методом, на трех уровнях концентраций.

Для выполнения анализа необходимо взять навески модельной смеси на трех уровнях концентраций.

Первый уровень – для анализа берут навески меньшие, чем указано в методике.

Второй уровень – для анализа берут навески, указанные в методике.

Третий уровень – для анализа берут навески большие, чем указано в методике.

На каждом уровне проведите три титрования.

Результаты занесите в таблицу 7.

Таблица 7 – Результаты определения правильности титриметрическим

методом

№ п/п	Уровень	Взято модельной смеси, (г или мл)	Взято лекарственного вещества, г	Объем титранта, мл	Найдено лекарственного вещества, г	R,%	Метрологические характери стики правильности
							= SD= RSD=

Задание 3. Рассчитайте метрологические характеристики для ингредиента, определяемого титриметрическим методом.

2.5. Валидационная оценка методик спектрофотометрического анализа по показателю «Правильность».

Цель работы: научиться оценивать методики спектрофотометрического анализа по показателю «Правильность».

ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЛОК

См. раздел 2.4.

Самостоятельная работа студентов

Задание 1. Проведите анализ девяти образцов компонента модельной смеси определяемого спектрофотометрическим методом, на трех уровнях концентраций.

Для выполнения анализа необходимо взять навески модельной смеси на трех уровнях концентраций.

Первый уровень – для анализа берут навески меньшие, чем указано в методике.

Второй уровень – для анализа берут навески, указанные в методике.

Третий уровень – для анализа берут навески большие, чем указано в методике.

На каждом уровне проведите три определения(табл.8).

Таблица 8 – Результаты определения правильности спектрофотометрическим методом

№ п/п	Уровень	Взято модельной смеси,(г или мл)	Взято лекарственного вещества, г	А	Найдено лекарственного вещества, г	R,%	Метрологические характеристики
							= SD= RSD=

Задание 2. Рассчитайте метрологические характеристики для ингредиента, определяемого спектрофотометрическим методом.

Дата добавления: 2015-10-21