Условия, в которых находится флуоресцирующее вещество

Растворитель может оказывать влияние на величину разности между X_max спектра поглощения вещества (или спектра возбуждения флуоресценции) и спектра испускания. При увеличении диэлектриче­ской проницаемости растворителя эта разность, называемая Стоксо- вым сдвигом, увеличивается. Растворитель влияет также и на вели­чину квантового выхода флуоресценции, увеличивая её или умень­шая. Например, квантовый выход флуоресценции эозина в воде равен 0,2, а в ацетоне - близок к 1.

Рис. 21.4. Зависимость между интенсивностью флуоресценции и оптиче­ской плотностью раствора 1) рассчитанная по упрощённой формуле I = KC; 2) реальная

a

Влияние рН сказывается на флуоресценции тех веществ, в мо­лекулах которых имеются функциональные группы, склонные к ки­слотно-основному взаимодействию. Например, фенол и его производ­ные флуоресцируют в кислой среде, при ионизации фенольного гид- роксила флуоресценция исчезает. Органические вещества, цвет и ин­тенсивность флуоресценции которых изменяется при изменении рН, могут быть использованы в качестве кислотно-основных индикаторов (флуоресцеин, хинин и т. п.).

При повышении температуры увеличивается вероятность бе- зызлучательных переходов, поэтому интенсивность флуоресценции уменьшается. Однако, у некоторых веществ свечение прекращается уже при -100^оС, другие продолжают слабо флуоресцировать даже при >100^оС. Если поместить флуоресцирующее вещество в специальную среду и охладить до температуры кипения жидкого азота (или даже жидкого гелия), то можно добиться того, что спектр флуоресценции органического вещества станет линейчатым. Такое явление называет­ся эффектом Шпольского. Использование данного эффекта значи­тельно повышает избирательность анализа и снижает предел обнару­жения.

Интенсивность флуоресценции вещества и её квантовый выход могут снижаться в присутствии в растворе других веществ, называе­мых тушителями. Существуют, так называемые, универсальные ту­шители (например, O₂), которые уменьшают флуоресценцию боль­шинства веществ. Однако, чаще тушитель влияет на флуоресценцию одного вещества и не влияет на флуоресценцию другого (например, хлориды уменьшают интенсивность флуоресценции хинина), по­скольку эффект тушения в разных случаях имеет различный меха­низм. Влияние концентрации тушителя на интенсивность флуорес­ценции вещества описывается уравнением Штерна-Фольмера

где I_q - интенсивность флуоресценции в присутствии тушителя, O_q - концентрация тушителя, k - константа тушения.

21.2.5. Измерение аналитического сигнала

Для измерения интенсивности флуоресценции используют спек- трофлуориметры и флуориметры (на рис. 21.5).

В качестве источника излучения используют ртутную, ксеноно- вую и другие лампы. В последнее время для возбуждения флуорес­ценции применяют лазеры.

Для выделения нужного спектрального интервала в флуоримет- рах, как и в фотоэлектроколориметрах, используют светофильтры, а в спектрофлуориметрах, также как и в спектрофотометрах - монохрома- торы (дифракционные решётки или призмы). Светофильтр (монохро- матор), используемый для выделения необходимого возбуждающего излучения, называется первичным, а для выделения наиболее интен­сивного излучения из спектра испускания - вторичным.

Рис. 21.5. Принципиальная схема прибора для измерения интенсивности флуоресценции

Измерение флуоресценции, в отличие от измерения поглощения, чаще всего проводят под прямым углом к направлению возбуж­дающего света. Такой приём позволяет избежать наложения возбуж­дающего света на излучаемый. При измерении интенсивности фосфо­ресценции, либо при большом Стоксовом сдвиге, можно использо­вать схему, при которой источник возбуждения, образец и детектор находятся на одной оптической оси. В данном случае возбуждающий свет не мешает определению, так как при измерении интенсивности фосфоресценции измерение проводят после прекращения действия возбуждающего света, а при большом Стоксовом сдвиге ^_возб и ^_исп настолько различаются, что возбуждающий свет задерживается моно- хроматором и не попадает на детектор. В случае сильно поглощаю­щих растворов, полупрозрачных и твёрдых образцов используют фронтальный способ, при котором измерение флуоресценции прово­дится под углом 45° относительно возбуждающего излучения.

При измерении флуоресценции имеют дело со слабым излуче­нием, поэтому в качестве детектора используют не фотоэлементы, как в спектрофотометрии, а фотоумножители.

21.2.6. Практическое применение и основные приёмы люми­несцентного анализа

К люминесцентной спектроскопии относят:

• флуоресцентный метод анализа (флуориметрия),

• фосфоресцентный метод анализа (фосфориметрия),

• хеми- и биолюминесцентный метод анализа (люминометрия) и

др.

Наиболее широкое применение среди перечисленных люминес­центных методов анализа имеет флуориметрия. По сравнению со спектрофотометрией флуориметрия обладает:

• большей избирательностью (не все вещества, поглощающие УФ- и видимое излучение, способны флуоресцировать);

• более низким пределом обнаружения (измерить абсолютную величину малого сигнала всегда легче, чем разность между двумя большими сигналами);

• удобным временным диапазоном.

Поглощение света - это практически мгновенный процесс (10^-15 - 10^-16 с), флуоресценция длится около 10 нс (а фосфоресценция значи­тельно дольше). За это время с молекулой могут произойти различные процессы, которые влияют на характеристики флуоресценции. Данное свойство широко используется в биохимии для изучения строения мембран, диффузии биомолекул, динамики связывания антигенов и антител. Влияние вращения молекул антигенов (лекарств, ядов), ме­ченых флуоресцеином, на поляризацию флуоресценции последнего лежит в основе поляризационного флуороиммуноанализа, одного из современных методов анализа биологических объектов.

Флуоресцентный анализ используют для обнаружения и для ко­личественного определения веществ. В качественном анализе чаще всего используется способность вещества флуоресцировать тем или иным цветом. При этом в качестве источника возбуждения обычно используют УФ-лампу, а наличие или отсутствие флуоресценции оп­ределяют визуально. Таким образом, например, обнаруживают флуо­ресцирующие вещества на плоскостных хроматограммах.

В количественном анализе используют зависимость интенсивно­сти флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества либо, реже, зависимость уменьшения интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в роли которого выступает вещество, кон­центрацию которого необходимо определить.

В флуоресцентном анализе используется:

• измерение собственной флуоресценции вещества;

• получение флуоресцирующих продуктов, в том числе и экс­тракционная флуориметрия;

• определения, основанные на тушении флуоресценции;

• титрование с флуоресцентными индикаторами и др.

Флуориметрическое определение, основанное на собственной флуоресценции, используется для определения хинина, берберина, рибофлавина, фторхинолонов, флуоресцеина и т.д.

рибофлавин офлоксацин Обратите внимание на особенности структуры флуоресцирующих ве­ществ - наличие в составе их молекул конденсированных ароматических систем.

В основе реакций получения флуоресцирующих продуктов мо­гут лежать различные процессы: окисления, конденсации, образова­ние комплексных соединений, ионных ассоциатов и др. Если обра­зующийся продукт мало растворим в воде, неустойчив в водном рас­творе, либо избыток реагента мешает определению или влияет на ус­тойчивость продукта, применяют экстракционную флуориметрию. Иногда вещество не флуоресцирует или слабо флуоресцирует в вод­ной среде, но интенсивно флуоресцирует в среде органического рас­творителя.

экстракт флуоресцирует ярко голубым светом (430-435 нм)

.CH₃

K3[Fe(CN)6]

"NH^S'

экстракция бутанолом

N

тиохром

CH3

© N

N' Л, H₃C N

w N X H₃C N

CH₂CH₂OH

CH2CH2OH

тиамин

Флуориметрическое определение, основанное на тушении флуо­ресценции, применяют для определения сульфаниламидов (тушат флуоресценцию 9-хлоракридина), Р-лактамных антибиотиков (тушат флуоресценцию меркурохрома) и т.д.

К новым подходам в люминесцентной спектроскопии относятся:

производная спектрофлуориметрия; синхронная спектрофлуориметрия; спектроскопия, основанная на эффекте Шпольского; флуоресцентная спектроскопия узких линий, фосфориметрия при комнатной температуре и др.

ГЛАВА 22

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА

22.1. Общая характеристика

Хроматография - метод разделения смесей веществ или час­тиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе, состоящей из несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз.

Хроматография - гибридный метод анализа, включающий раз­деление веществ и их последующее определение при помощи специ­альных устройств - детекторов.

В качестве неподвижной фазы в хроматографическом процессе выступает твёрдое вещество (сорбент) или плёнка жидкости, нане­сённая на твёрдый носитель, а в качестве подвижной фазы - жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

В отличие от статических методов разделения - сорбции и экс­тракции хроматография является динамическим процессом. При перемещении через неподвижную фазу подвижная фаза встречает на своём пути всё новые и новые слои сорбента, что сопровождается многократными повторениями актов сорбции и десорбции разделяе­мых веществ. Хроматографическое разделение обладает большей эф­фективностью по сравнению со статическими методами.

"Схвати, подержи и отпусти"

22.2. Классификация хроматографических методов

Существует более 50 различных хроматографических методов и вариантов. В основу их классификации могут быть положены:

• агрегатное состояние подвижной и неподвижной фазы,

• геометрическая форма неподвижной фазы,

• преобладающий механизм разделения,

• цель проведения,

• способ получения хроматограммы и т.д.

АГРЕГАТНОЕ СОСТОЯНИЕ ПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ

подвижная фаза - газ		газовая			жидкостная	подвижная фаза -
1 / 1 1				f / / t /	i i i i	-^жидкость ^4 S
газо- твёрдофазная	газо­жидкостная		жидкость- жидкостная	жидкость- твёрдофазная	жидкость- гелевая
	ВИД НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ

В названии хроматографического метода первым указывается агрегатное состояние подвижной фазы, а вторым - неподвижной

Колоночный вариант используется как в жидкостной, так и в газовой хроматографии, а плоскостной - только в жидкостной.

Классификация хроматографических методов в зависимости от преобладающего механизма разделения, приведена в табл. 22.1.

Реальный процесс обычно включает в себя несколько механиз­мов, обуславливающих разделение веществ, поэтому данная класси­фикация условна.

Табл. 22.1. Классификация хроматографических методов в зависимости от преобладающего процесса, лежащего в основе разделения веществ

Вид хроматографии	Преобладающий механизм разделения
адсорбционная	различная адсорбируемость разделяемых ве­ществ неподвижной фазой
адсорбционно- комплексообразовательная	образование (в подвижной фазе или на поверх­ности неподвижной фазы) различных по устой­чивости комплексных соединений
аффинная	различная способность разделяемых веществ к биоспецифическим взаимодействиям
ионообменная	различная способность разделяемых веществ к ионному обмену
осадочная	образование осадков, различающихся по рас­творимости
распределительная	различная растворимость разделяемых веществ в неподвижной фазе или в подвижной и непод­вижной фазах
эксклюзионная	различия в размерах и форме молекул разделяе­мых веществ

технологическая

Целью является само разделение. Применяется для выделения целевого компонента из смеси либо для его очистки.

ЦЕЛЬ ПРОВЕДЕНИЯ

информационная

Цель - получение информации о составе объекта (аналитическая хроматография) либо о его физико-химических свойствах (физ ико-х имическая хроматография)

щэ

По способу получения хроматограммы хроматография бывает элюентной, фронтальной и вытеснительной (табл 22.2).

Способы получения хроматограммы

Получение хроматограммы

Сорбент, находящийся в хроматографической колонке, вначале промывают подвижной фазой (элюентом), обладающей мень­шим сродством к неподвижной фазе, чем любое из разделяемых веществ. Затем в колонку вводят исследуемую смесь веществ и продолжают непрерывно пропускать элюент. сигнал

E

Вид хромато­графии Элюентная (прояви- тельная)

детектора

A + E

B + E

Табл. 22.2.

t (V)

Вытесни- тельная

Самый эффективный и в настоящее время практически единственный способ получения хроматограммы в количе­ственном анализе

Вначале в колонку вводят некоторое количество разделяемых веществ, которые распределяются в ней в порядке их сродства к неподвижной фазе. Затем в поток подвижной фазы вводят веще­ство-вытеснитель, которое имеет большее сродство к неподвиж­ной фазе, чем любой из компонентов разделяемой смеси. Фронт вытеснителя движется по колонке, вытесняя ранее сорбирован­ные вещества, которые, в свою очередь, вытесняют друг друга.

сигнал детектора

D (вытеснитель)

B

A

E

--------------- t (V)

Фронталь­ная

Используется, в основном, для разделения макроколичеств веществ в препаративных целях.

В колонку непрерывно вводят раствор разделяемых веществ. Из колонки вначале будет выходить чистый растворитель, затем растворитель вместе с компонентом смеси, наименее прочно удерживаемым неподвижной фазой, затем смесь растворителя, наименее прочно удерживаемого компонента и следующего по

удерживанию компонента и т. д. сигнал

/

детектора

A+ B + E

A

A + E

E

t (V)

Метод использовался на ранних стадиях развития хромато­графии.

22.3. Хроматографические параметры

Расположение разделяемых веществ в виде отдельных зон вдоль колонки называют внутренней хроматограммой, а графическое изо­бражение состава элюата (подвижной фазы, содержащей разделённые вещества), выходящего из колонки, получаемое, например, с помо­щью самописца - внешней хроматограммой.

Дата добавления: 2015-09-07