Семинар 3. Последовательность этапов дальнейшей теоретической реконструкции кинетики

Последовательность этапов дальнейшей теоретической реконструкции кинетики воспроизводства и их обсуждение

· оптимизация перебором качественно различающихся вариантов кинетики от начала (идея/подход и ожидаемый основной вариант начального этапа кинетики воспроизводства бактериофага)

Дискриминация посадки на +РНК в сравнении с посадкой на –РНК неизбежна (из-за прямого эффекта сбоя трансляции + перерасход нуклеотидов), в противном случае большие потери или даже невозможность синтезировать белок. Заметные потери, даже если отношение v₊ / v_– = 100 (т.е. в 400 раз слабее рационального отношения по стационарным характеристикам). Это значит, что будет задержка при посадке первой репликазы на исходную +РНК.

собственно перебор

Как следствие:

1) вариант посадки первой репликазы (или одной из первых) сразу после ее синтеза имеет очень малую вероятность (хотя практически возможен при такой вероятности)

2) вариант посадки многих репликаз на исходную +РНК абсолютно невероятен

3) ожидание по вероятности: посадка одной репликазы на исходную +РНК с существенной задержкой, как основной вариант.

Следствие: за время задержки будет синтезировано избыточное число репликаз + естественно предположить насыщение для посадки на +РНК и –РНК при таком количестве

Комментарий (с точки зрения целесообразности для воспроизводства вируса): сразу начать репликацию (синтез –цепи на исходной +цепи): невозможно и проигрыш (не получаем эффекта от дискриминации на следующем шаге); долго ждать – тоже проигрыш. Напротив, ничего не проигрываем (при наличии эффекта дискриминации), если к моменту появления первой –цепи имеем полный набор репликаз для нее + буфер, включающий синтез следующей (второй –цепи). Тогда и способ описания зависимости посадки репликаз (константа Михаэлиса около 30–50 для обеих скоростей посадки + фактор дискриминации около 100)

При таком ожидании (по вероятности)

результат первого этапа: накапливаются десятки репликаз (и примерно столько же белка оболочки)

следующий (второй) этап – синтез одной (!) –цепи (а больше и не нужно, чтобы задействовать имеющиеся репликазы (при этом синтез репликаз прекращается до ухода репликазы в область кодирования А-белка, некоторое количество БО будет произведено, но меньшее, чем на первом этапе)

третий этап – начало массового синтеза +РНК, при этом может происходить использование только малой их части (включая исходную +РНК) в незначительной мере для производства –цепей

· неустойчивость кинетики, включая концентрационные пики репликазы в месте окончания ее синтеза (оно же – место ее посадки на +РНК для синтеза –РНК) и их количественное выражение: репликаза может сесть на +РНК в любой момент после синтеза 1-й репликазы, хотя по вероятности это произойдет с существенной задержкой (дальше обсуждаем этот наиболее вероятный вариант)

(!) при обсуждаемом сценарии (с длительным накоплением репликаз перед синтезом первой –цепи) кинетика исключительно неустойчива (особенно в сравнении с противоположным вариантом быстрой посадки репликазы).

(М) В этом случае любой вариант численного счета плохо отражает происходящее, нужно искать инварианты семейства возможных кинетик (понятие «биологической кривой» чрезвычайно актуально, хотя не связано с фундаментальной непредсказуемостью, а вызвано ситуационным усилением непредсказуемости чисто случайного характера).

= «компьютер нам ничего не скажет», но можно установить устойчивые взаимосвязи, что мы здесь и делаем

+ эффект локального увеличения концентрации репликаз в момент окончания синтеза каждой очередной репликазы («пилообразный профиль концентрации с обрезанием при любой инерции – сборка активных комплексов как в данных, созревание белка и т.п.) усиливает минорный вариант быстрой посадки репликазы

(Д) характерное время естественного сглаживания – время посадки t (порядка 1 с для –РНК и 1 мин для +РНК), тогда эффект мал как среднее (sqrt(6Dt), где коэффициент диффузии D порядка 10^–6см²с^–1), но точнее нужно учитывать физико-химический механизм, который здесь удалось не обсуждать как существенно важный для установления основных связей в кинетике (он не влияет на логическую схему)

Следующий шаг – анализ кинетики +РНК и –РНК на этапе разгона (после начального накопления репликаз – по вероятности), рассматривая их как связанные процессы (если специально не регулировать, экспериментальных оснований нет, поэтому, не учитываем; оценку целесообразности как более точную – через экономику)

· относительная и абсолютная кинетика +РНК и –РНК (при избытке репликаз)

При избытке репликаз (как по целесообразности для воспроизводства вируса) описание синтеза +РНК и вместе с ним синтеза –РНК упрощается

d(+РНК)/dt = k₊ (–РНК) (7)

d(–РНК)/dt = k_– (+РНК) (8)

Обозначения (+РНК) = x, (–РНК) = y.

dx/dy = k₊/k_– y/x.

x² = k₊/k_– y²,

dx/dt = k₊ y = sqrt(k₊ k_–) x

x = x₀ exp[sqrt(k₊ k_–) t]

Уравнения приближенные с учетом запаздывания, причем время запаздывания существенно, по сути, запаздывание определяет посадка репликаз на +РНК.

(М) время запаздывания можно представить как неточность (сдвиг к началу оценка с одной стороны, сдвиг к концу – оценка с противоположной).

При соотношении k_– = 1/100 k₊ = 1/200 с^–1 получаем время разгона (условно до уровня 1000 +РНК, т.к. экспоненциальная кинетика уже при меньших значениях ограничена наблюдаемым числом репликаз около 1000) в пределах 10 минут.

Подробнее: не менее 7–8 минут, включая минуту до синтеза первой репликазы, 3 минуты до посадки репликазы уже при их избытке и 3 мин – собственно экспоненциальный участок.

Тогда соотношение концентраций

(+РНК)/(–РНК) = 10

и это ожидаемый вариант одновременно по целесообразности и соответствию наблюдаемой кинетике.

Если k_– существенно больше, чем 1/100 k₊, то большие потери и разгон быстрее наблюдаемого.

Если k_– существенно меньше, чем 1/100 k₊, то уже не вписываемся по времени. При k_– = 1/400 k₊ = 1/800 с^–1 разгон больше 20 минут.

Комментарий: по сути, оценку ожидаемых значения констант и скоростей получили перебором малого числа вариантов численных значений, это оптимизация (с реально требуемой точностью).

Такой прием обоснован тем, что, с одной стороны, есть чувствительность кинетики воспроизводства к выбору этих значений, с другой стороны, сами значения как точные не имеют смысла по физико-химическим соображениям.

(физико-химическая невоспроизводимость при энергетической характеристике в показателе экспоненты с малым знаменателем).

Для сравнения: выше был оптимизация перебором качественно различающихся вариантов.

· регуляция синтеза репликазы белком оболочки

(М) относительная кинетика как следствие (1)–(2)

Имеем избыток –РНК (в сравнении с потребностями для основного производительного этапа), тогда при наличии избытка репликаз получим перепроизводство +РНК, сбой синтеза белка и непроизводительный расход мономеров + быструю раскрутку таких потерь. С учетом целесообразности для воспроизводства вируса такое развитие кинетики нужно вовремя остановить, поэтому важно обсудить регулирующий механизм: переключение с синтеза РЕП на выключение синтеза нужно производить, но после синтеза критического количества РЕП.

= избыток репликаз представляет особую опасность, поэтому начинаем анализировать кинетику с этой точки зрения

Ориентировочный график (по целесообразности):

… (отношение РЕП/R от R)

Тогда начальный участок зависимости отношения РЕП/R от R (с учетом целесообразности для воспроизводства вируса) – это постоянство на уровне 1, конечное – это нуль.

(М) репрессия мономером БО как предположительно негативный сценарий (интегрирование в общем виде + решение трансцендентного уравнения перебором, упрощенная версия – приближенное)

Следствие: репрессия по механизму связывания с мономером репрессора препятствует кинетике воспроизводства, т.к. быстрое убывание начинается сразу же на начальном участке/этапе.

Подробнее, кинетические уравнения

Если разделить (1) на (2) и учесть связывание с ингибитором, то

dR/dРЕП = (Ko + R)/ Ko

После разделения переменных и интегрирования связь конечных концентраций репрессора и ингибитора дает уравнение (трансцендентное относительно Ko)

1 + R/Ko = exp(РЕП/Ko),

для решения которого приняты значения РЕП = 1000 и R = 2 10⁶ (относительно последнего см. комментарий далее).

(К) единственный параметр – константа связывания с +РНК представляет характерное значение, при котором происходит убывание. Если мало, то убывания нет на начальном участке, но нет и на конечном. Если велико, то сразу же и до конца. Если подобрать, чтобы получить требуемое различие конечных отношений, то ему соответствует значение константы связывания

Отсюда Ko = 100.

(М) графическое представление отношения dРЕП/dR: сразу же убывание

(Д) при 100 БО и РЕП (с чего начинается экспоненциальная кинетика – см. далее) скорость меньше в 2 раза (а по сути, она входит в показатель экспоненты), и в 10 раз падает при 1000 БО.

Иными словами, при этом варианте ингибирование происходило бы слишком рано, что, очевидно, неприемлемо для вируса. Поэтому необходима более сложная (т.е. кооперативная регуляция) с участием двух или большего числа молекул БО.

Значит, такие варианты необходимо обсуждать.

Вариант репрессии димером

dРЕП/dR = Ko /(Ko + R₂) = Ko /(Ko + R/2 – K_R/8 [sqrt(1 + 8 R/K_R) –1])

(М) графическое представление отношения dРЕП/dR: при малых значениях аргумента РЕП/R = 1, убывание с точкой перегиба при значениях R порядка K_R (реально K_R оказывается в несколько раз меньше, чем 1000 – см. аналитический расчет или численные значения K_R в связи с Ko).

(М) вариант: интегрирование с разрезанием на фрагменты (полезность предшествующего варианта – примерно такое же значение константы связывания Ko)

Дальнейшее обсуждение:

репрессия димером как препятствие для воспроизводства, вывод об эффекте регулирования димером и обсуждение потребности в более высокой кооперативности… (предмет для заданий)

Продолжая обсуждение и делая дальнейшие шаги, получим более полную реконструкцию кинетики воспроизводства бактериофага…

А здесь тему воспроизводства бактериофага на этом заканчиваем, общее представление уже получили.

В результате вышли на возможность сформулировать большое число заданий в связи с рассмотренным сюжетом – задания будут представлены дополнительно

А полученные оценки можно сравнить с экспериментальными данными из статьи – те же значения отношения концентраций +РНК и –РНК, количество репликазы, кинетика синтеза РНК (+ есть количественные характеристики, которые также следуют из оценок, но данных для сравнения пока нет – интереснее всего, если не совпадут, тогда можно узнать много нового)

Если обсуждать сделанные шаги (элементы логической схемы), то все они разнообразны.

В частности, интересны косвенные аргументы в пользу необходимости кооперативной регуляции при ингибировании синтеза репликазы белком оболочки – обычного связывания с мономером недостаточно. Уместно вспомнить также аналогичные примеры оценок (недостаточности рассмотренной гипотетической организации) с фотосинтезирующей клеткой и укладкой ДНК – в сравнении с похожими примерами из математических курсов как переход к предельному значению с двух сторон (например, оценка числа е сверху и снизу = «правило двух милиционеров»).

Отличие в том, что при выборе варианта регуляции (и других качественных изменениях организации) невозможно непрерывное изменение числа используемых частиц. Можно соединить или связать с активным комплексом одну частицу, две, три и т.д. Но невозможно использовать при регуляции дробное число частиц.

И это оценка односторонняя, причем с вполне определенной стороны – от наиболее простого варианта, который, во-первых, сам по себе представляет важную возможность (как альтернативу возможной организации), а во-вторых, и это главное, дает существенный ориентир для потребностей в сравнении с ним.

Практически что получилось при теоретическом анализе и реконструкции количественных характеристик воспроизводства бактериофага (использованная логическая схема):

1) прямо невозможно сделать даже первый шаг, пока неясно соотношение количественных характеристик = базовый вариант не задан даже качественно как последовательность превращений и получения составляющих (конкретно: неясно, что будет происходить: синтез белка или синтез РНК, а это очень отличающиеся вариантs кинетики);

2) поэтому оцениваем ожидаемые значения концентраций от критического этапа массового производства, из нее следуют ориентиры как минимальные требования;

3) после этого из универсальных выражений скоростей молекулярного синтеза составляющих как соотношения скоростей синтеза +РНК и –РНК следует неизбежная корректировка ожиданий по концентрации –РНК (альтернатива: некоторая дополнительная регуляция: предмет для задания), а для начального этапа ясны альтернативы и наиболее вероятный ожидаемый вариант начальной кинетики;

4) тогда следуют экспоненциальная кинетика взаимного синтеза +РНК и –РНК, ограничение синтеза РЕП и анализ возможностей это осуществить, начиная с гипотетического варианта ингибирования мономером БО (такой вариант не реализован в данном случае, но позволяет оценить реальный проблемы и потребности регуляции в сравнении с ним)

Дата добавления: 2015-07-16