|
Читайте также: |
Ход работы. Определение гемоглобина в крови традиционно проводится на основе измерения окрашенного железопорфиринового комплекса. При этом используются разные фотометрические методы: цианметгемоглобиновый метод Драбкина, аммиачный метод и другие. Принцип этих методов заключается в подготовке из цельной крови с помощью трансформирующих растворов биопроб с последующим их фотометрированием.
Гемиглобинцианидный метод (метод Драбкина). В этом методе Fe+2 гемоглобина окисляется до Fe+3метгемоглобина, который затем переводится в стабильный цианметгемоглобин (CNmetHb). Абсорбция CNmetHb измеряется при 540 нм, при которой имеется максимум абсорбции. Этот метод характеризуется высокой точностью, простотой исполнения, дешевизной и возможностью выполнения на гематологических анализаторах. Для гемиглобинцианида фактор пересчета коэффициента оптической плотности в концентрацию гемоглобина является известной величиной и равен 367.7(Х=540 нм). Расчет проводится по следующей формуле:
Нв (г/л) = 367,7 х А 540нм, где A540нм - абсорбция раствора гемоглобина при длине волны 540 нм.
Ход определения. В пробирку с 5 мл трансформирующего раствора добавляют 20 мкл крови (капилляр Сали, разведение 1:251). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин. Измерения проводят на спектрофотометре при длине волны 540 нм или на фотоэлектроколориметре при длине волны 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм против холостой пробы (трансформирующий раствор.).
При использовании спектрофотометра с точной величиной длины волны (540 нм), расчет проводят по указанной выше формуле. При использовании ФЭК и зеленого светофильтра расчёт содержания гемоглобина производят по специальному калибровочному графику, который строится отдельно для каждого фотометра.
Аммиачный метод (модифицированный метод Дервиза-Воробьева). Сущность метода заключается в том, что все разновидности гемоглобина не переводятся в единую форму, а выполняется разведение пробы крови (различных производных гемоглобина) в 0,04% растворе аммиака. Для модифицированного метода Дервиза-Воробьева оптимальной (рабочей) полосой пропускания является точка 523 нм, при которой сводятся к минимуму ошибки измерения. В данной точке два производных гемоглобина - оксигемоглобин и метгемоглобин имеют одинаковое поглощение, поэтому результат фотометрирования не зависит от относительного содержания этих производных в растворе. Перед работой строится калибровочная кривая, по которой после фотометрирования рассчитывают концентрацию Нв.
Этот метод реализован в гемоглобинометре "МиниГЕМ-523", имеющем узкополосный светофильтр с максимумом пропускания на длине волны 523 нм. Методическая точность определения гемоглобина на гемоглобинометрах "МиниГЕМ-523"(предельно допустимое значение коэффициента обшей аналитической вариации) не превышает 1,5%, если концентрация карбоксигемоглобина в крови не превышает 10%.
1.12. ПОДСЧЕТ ЛЕЙКОЦИТОВ КАМЕРНЫМ МЕТОДОМ.
Ход работы и интерпретация результатов.
Разведение крови. Кровь из пальца насасывают в капилляр Сали в количестве 0,02 мл и вводят в пробирку, в которую налито 0,2 или 0,4 мл раствора уксусной кислоты с метиленовой синькой (разведение в 10 или в 20 раз).
Подсчет лейкоцитов. Уксусная кислота вызывает разрушение оболочки эритроцитов и лейкоцитов, а метиленовая синька окрашивает ядра лейкоцитов.
Заранее притирают покровное стекло к боковым площадкам счетной камеры Горяева до появления радужных колец.
После перемешивания выливают из смесителя на вату жидкость, находящуюся в капилляре смесителя (2—3 капли).
Заполняют камеру раствором с помощью капилляра Сали. Лейкоциты считают в 25 больших квадратах при малом увеличении.
Количество лейкоцитов в 1 мм3 крови считают по формуле
Л = [4000А *20 (10)]/ 400, где N/400 — среднее число клеток в 1 малом квадрате; 1/4000 — объем камеры под малым квадратом; 20 (или 10) - степень разведения крови. Внимание! Счет количества клеток в квадратах камеры Горяева проводится по правилу Егорова: к данному квадрату относятся только те клетки, которые находятся внутри квадрата или на его верхней и левой границе.
Рис.7. Камера Горяева и ее сетка под малым увеличением
1.13. ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ЭРИТРОЦИТОВ В КАМЕРЕ ГОРЯЕВА.
Ход работы и интерпретация результатов. Разведение крови для счета эритроцитов производят в пробирках. В этом случае для забора крови используют капилляр Сали (объем 0,02 мл), а в небольшую пробирку наливают соответствующее количество раствора (3% раствор NaCl) — 2 или 4 мл..
Рис. 8. Эритроциты в камере Горяева
Считают эритроциты под большим увеличением микроскопа в малых квадратах камеры Горяева по правилу Егорова. Необходимо просчитать 5 больших (т. е. 80 малых) квадратов сетки по диагонали. Формула подсчета эритроцитов в 1 мм3 крови:
Э =[4000 А *100(200)]/80,
где N/80 — среднее число эритроцитов в 1 малом квадрате, 1/4000 — объем камеры над малым квадратом; 100 (или.200) — степень разведения крови.
При выражении количества форменных элементов в системе СИ полученный результат необходимо умножить на 106. В этом случае результат будет выражен следующим образом: Э*1012 эритроцитов в литре крови, Л *109 лейкоцитов в литре крови.
Дата добавления: 2015-07-10; просмотров: 771 | Нарушение авторских прав