Аннотация. Экспериментально подтверждены преимущества комплексного антифунгального препарата

Экспериментально подтверждены преимущества комплексного антифунгального препарата, содержащего в своем составе полиеновый антибиотик 322 и ПАВ. Сочетанное использование антибиотика 322 с ПАВ повышает чувствительность грибов к нему и способствует снижению образования метаболитов, относящихся к факторам потенциальной патогенности грибов. В составе комплексного препарата минимальные фунгицидные концентрации антибиотика 322 снижаются в 1,2–3 раза. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности применения ПАВ в комплексе с антибиотиками для повышения фунгицидной активности и сокращения их норм расхода.

Ключевые слова: полиеновый антибиотик 322, комплексный антифунгальный препарат, факторы патогенности, пигменты, полисахариды, каталаза.

В настоящее время поиск и создание высокоэффективных антифунгальных средств защиты проводится по разным направлениям: это синтез новых, улучшение свойств уже используемых, поиск антифунгальных средств природного происхождения, в том числе, полиеновых антибиотиков [1-3].

Полиеновые антифунгальные антибиотики отличаются высокой активностью, специфичностью действия, к ним длительное время не появляются устойчивые формы микроорганизмов [4], они способны подавлять одну из основных протекторных функций грибов - образование пигментов, определяющих их устойчивость к воздействию любых фунгицидов и других неблагоприятных факторов [3,5,6].

Однако независимо от того, какой фунгицид предлагается для использования – получаемый методом химического синтеза или образуемый в природе – необходимо стремиться к повышению его фунгицидной активности, результатом чего будет снижение его количества в окружающей среде.

Следует отметить, что кроме определения фунгицидного эффекта важно оценить степень влияния антифунгальных средств защиты на адаптационные факторы патогенности грибов. Так, известно, что некоторые фунгициды могут способствовать усилению потенциально-патогенных свойств грибов [7], что может привести к появлению в антропогенном сообществе грибов, опасных для здоровья человека.

Настоящая работа посвящена повышению фунгицидной активности нового природного полиенового антибиотика 322, целенаправленно выделенного для защиты от микоповреждений, и изучению влияния комплексного препарата на основе антибиотика 322 и поверхностно-активного вещества (ПАВ) на факторы потенциальной патогенности грибов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе в качестве тест-культур использовали мицелиальные грибы, относящиеся к наиболее распространенным биодеструкторам различных материалов и полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов: Aspergillus niger van Tieghem 1867 F - 1119, Aspergillus terreus Thom 1918 F - 1025, Penicillium funiculosum Thom 1910 F-1115, Penicillium ochrochloron Biourge 1923 F - 1702, Aspergillus flavus (Link 1809) Fries 1832 F – 25.

Культивирование грибов проводили поверхностным способом на среде Чапека с 2% крахмала в чашках Петри, а также в колбах объемом 250 мл с 50 мл жидкой среды в статических условиях или на качалке Certomat BS-1 при 24-26°С, 230 об/мин. Продолжительность культивирования составляла 5 - 10 суток в зависимости от способа культивирования и цели эксперимента.

Прирост биомассы микромицетов определяли весовым методом, количество пигментов - методом водно-щелочной экстракции с последующим осаждением их при подкислении до рН 2.0, высушиванием и взвешиванием [8].

Экзополисахариды грибов, содержащиеся в нативном растворе, осаждали этанолом, отделяли от раствора центрифугированием при 5000 об./мин в течение 15-20 мин, осадок высушивали при 120ºС и взвешивали. Количество полисахаридов выражали в миллиграммах на 1 г абсолютно сухой биомассы (а. с. б.) [9].

Активность каталазы контролировали методом, основанным на титрометрическом определении количества разложившейся перекиси в течение определенного времени. За единицу активности фермента принимали его количество, катализирующее разложение 1 мкМ Н₂О₂ за 1 мин., и выражали в ед/г а.с.б. [10].

В качестве фунгицида использовали антибиотик природного происхождения – сырец полиенового антибиотика 322 (гептаен), целенаправленно выделенный для защиты от микоповреждений [11]. Концентрацию антибиотика в среде варьировали в зависимости от чувствительности грибов и с таким расчетом, чтобы степень подавления прироста биомассы не превышала 60%. В качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) использовали хлоргексидина биглюконат (ХГБ), производства ООО «РОСБИО», Россия, в концентрациях – от 1·10-5 до 5·10-3 % (массовых).

Обработку экспериментальных данных проводили c использованием пакета программ Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Из литературных данных известно, что использование в качестве антифунгальных средств комплексных препаратов фунгицид с ПАВ имеет ряд преимуществ по сравнению с действием только одного фунгицида [3,12,13]. Под действием ПАВ увеличивается клеточная проницаемость микромицетов, повышается их чувствительность к фунгициду, что позволяет снизить концентрацию фунгицидов в среде и, в ряде случаев, уменьшить образование микромицетами пигментов, полисахаридов, фосфолипаз [12,13]. Этот подход был апробирован нами с целью повышения чувствительности грибов к антибиотику 322 и снижения некоторых факторов патогенности.

В качестве ПАВ был выбран - хлоргексидина биглюконат (ХГБ).

Для определения фунгицидного эффекта от сочетанного действия двух монопрепаратов (антибиотика 322 и ХГБ) на грибы использовали индекс FFC (Fractional Fungicidal Concentration Indice) [14]. Индекс FFC рассчитывают по следующей формуле [14,15]: МФКас /МФКа + МФКбс /МФКб, где: МФКас – минимальная фунгицидная концентрация антибиотика 322 (в мкг/мл), взятого в сочетании с ХГБ; МФКа - минимальная фунгицидная концентрация антибиотика 322 (в мкг/мл), взятого как монопрепарат; МФКбс – минимальная фунгицидная концентрация ХГБ (в мкг/мл), взятого в сочетании с антибиотиком 322; МФКб – минимальная фунгицидная концентрация ХГБ (в мкг/мл), взятого как монопрепарат.

Наблюдаемый эффект при сочетанном применении [14,15]: FFC ≤ 0,5 – синергидное действие; 0,5 < FFC ≤ 1 – аддитивное действие; 1 < FFC ≤ 2 – нейтральное действие; FFC > 2 – антагонистическое действие;

В таблице 1 представлены минимальные фунгицидные концентрации антибиотика 322 и ХГБ при их индивидуальном и сочетанном использовании в глубинных условиях на среде Чапека с 2 % глюкозы в течение 5 суток при температуре 24-26°С. Видно, что для 4-х из 5 культур микромицетов наблюдается аддитивный эффект при совместном воздействии антибиотика 322 и ХГБ (0,5 < FFC ≤ 1), а для культуры Penicillium ochrochloron проявляется синергидное действие комплексного препарата (FFC = 0,43). Следует отметить, что при комплексном использовании существенно снижаются минимальные фунгицидные концентрации как антибиотика 322 (в 1,2 – 3 раза), так и ХГБ (в 10 - 100 раз), что, несомненно, является перспективным способом снижения антропогенной нагрузки на окружающую среду.

При изучении влияния антибиотика 322 в комплексе с ХГБ на образование факторов патогенности оппортунистических грибов выявлено, что у всех исследованных тест-культур, за исключением культуры Aspergillus terreus (Рис. 1), происходит снижение образования пигментов до уровня более низкого, чем при воздействии только одного антибиотика. Так у A. niger воздействие комплекса приводит к полному ингибированию синтеза пигментов, а у культур A. flavus и Penicillium funiculosum наблюдается снижение пигментообразования на 31-47% соответственно по сравнению с контролем. Исключение составляет культура A. terreus, у которой продуктивность биомассы по пигментам возрастает на 32% по сравнению с контролем. Вероятно, данный эффект обусловлен тем, что сам ХГБ вызывает у исследуемой культуры значительную стимуляцию синтеза пигментов (на 55% по сравнению с контролем).

Таблица 1

Дата добавления: 2015-08-21