На поверхні F1 АТР перебуває у більш стабілізованому стані, ніж ADP

Експерименти по ізотопному обміну з виділеним компонентом F₁ виявили дивовижну особливість механізму ензиматичного каталізу: реакція ADP + P_i ↔ АТР + Н₂О, що протікає на поверхні ензиму, є легко оборотною – зміна вільної енергії у реакції синтезу АТР близька до нуля! Якщо F₁ здійснює гідроліз АТР у присутності ¹⁸О-міченої води, то вивільнений Р_і містить атом ¹⁸О. Точні вимірювання вмісту ¹⁸О у складі Р_і, який утворюється in vitro внаслідок гідролізу АТР компонентом F₁ показали, що молекула Р_і містить не один, а три або чотири атоми ¹⁸О (Рис. 19-21). Ці дані вказують на те, що кінцевий залишок пірофосфата неодноразово відщеплюється від молекули АТР і знову приєднується, перш ніж від’єднатися від поверхні ензиму. Оскільки Р_і вільно обертається у своєму центрі зв’язування, то під час кожного акта гідролізу АТР атом ¹⁸О випадково включається у будь-яке з чотирьох положень у молекулі. Така реакція обміну протікає у деенергезованих комплексах F₀F₁ (тобто, за відсутності протонного градієнта), і за наявності ізольованого компонента F₁ – адже обмін не потребує енергії.

Кінетичні дослідження початкової швидкості синтезу АТР та його гідролізу підтвердили висновок про те, що величина Δ G^`0 для реакції синтезу АТР на поверхні ензиму є близькою до нуля. На основі виміряних швидкостей гідролізу (k ₁= 10 c^-1) та синтезу (k _-1= 24 c^-1) було розраховано, що константа рівноваги для реакції

Енз-АТР↔Енз-(ADP + P_і)

дорівнює

К ΄_eq = k _-1/ k ₁ = 24 c^-1/10 c^-1 = 2,4

Розраховане на основі К΄ _eq значення уявної Δ G’⁰ є наближеним до нуля. Ці параметри дуже відрізняються від тих, що характерні для гідролізу вільного АТР у розчині (К _eq приблизно дорівнює 10⁵, а ΔG ^`0 = -30,5 кДж/моль), а не на поверхні ензиму.

Що є причиною такої величезної різниці? Міцніше зв’язуючи АТР на своїй поверхні, АТР-синтаза стабілізує АТР відносно ADP+Р_і з тим, щоб вивільнюваної енергії було достатньо для компенсації енергетичних витрат на синтез АТР. Точні вимірювання констант зв’язування показали, що комплекс F₀F₁ з дуже високою спорідненістю зв’язує АТР (К _d < 10^{-12 М),} і з набагато нижчою - ADP (К _d» 10^{-5 М). Така відмінність у величині К} _d означає, що різниця у величині енергії зв’язування становить приблизно 40 кДж/моль, саме ця енергія зв’язування і є рушійною силою для зміщення рівноваги у бік утворення АТР.

Для від’єднання АТР від поверхні ензиму використовується енергія протонного градієнта

Хоча в активному центрі АТР-синтази між АТР та АDР+Р_і встановлюється рівновага, за відсутності протонного градієнта новосинтезована молекула АТР не від’єднується від поверхні ензиму. Саме протонний градієнт змушує ензим вивільнити утворений на його поверхні АТР. Координатна діаграма реакції (Рис. 19-22) ілюструє різницю між механізмом роботи АТР-синтази та багатьох інших ензимів, що каталізують ендергонічні реакції.

Щоб забезпечити постійний синтез АТР, ензим повинен безперевно переходити з міцно зв’язаної з АТР форми у форму, яка вивільняє АТР. Структурну основу такої зміни функції АТР-синтази було з’ясовано у результаті хімічних та кристалографічних досліджень.

Дата добавления: 2015-08-18