Род Бордетеллы

Род Bordetella входит в семейство Halobacteriaceae и включа­ет три вида: Bord. pertussis, Bord. parapertussis и Bord. bronchisep-tica.

Wright P. (1991) подчеркивает особенности распространения коклюша в развивающихся странах, связанные с несвоевремен­ной его диагностикой вследствие трудностей культивирования Bord. pertussis.

Для количественных процедур при выявлении и изоляции Bord. pertussis из клинических образцов используется агаровая основа Борде-Жангу (Bordet-Gengou), предложенная еще в 1906 году. Среда превращается в селективную при добавлении мети-циллина. Kendrick, Eldering (1934) заменили 50% человеческой или кроличьей крови, рекомендованной в оригинальной пропи­си, на 15% овечьей, с целью сделать среду более практичной для лаборатории. Кровяной агар Борде-Жангу представляет собой обогащенную казеиновым пептоном среду с добавлением карто­феля и глицерина, являющихся источниками питания Bord. per­tussis. Дефибринированная овечья кровь также обеспечивает пи­тание и, кроме того, позволяет детекцию гемолитических реак­ций с целью идентификации данного микроорганизма.

Гладкие формы Bord. pertussis на среде Борде-Жангу образу­ют колонии блестящие, жемчужно-серого цвета, выпуклые, с диаметром 0,25—1 мм. Они не растут на шоколадном, кровяном, асцитном агарах и среде Лефлера; индол в пептонной воде не об­разуют, углеводы не ферментируют. Колонии промежуточных форм не отличимы от гладких, но на среде Борде-Жангу отмеча­ется гемолиз. Они хорошо растут на кровяном и шоколадном агарах, средах Филдса, Лефлера и МПБ. Шероховатые формы, появляющиеся только при культивировании в лабораторных ус­ловиях, растут на всех средах. На среде Борде-Жангу гемолиз от­сутствует, колонии сухие, зернистые, непрозрачные, коричнево­го цвета (Захарова М. С, Кирьянова Г. П., 1980).

Bord. pertussis не нуждаются для роста в СО:, но некоторые исследователи используют при выращивании 5—10% СОз. При культивировании на угольном агаре к нему добавляют 10% де-фибринированной лошадиной или овечьей крови. В бактерио­логических лабораториях развивающихся стран часто более до­ступна кровь человека. По вышеперечисленным причинам Норре J.. Schlagenhauf M. (1989) изучали влияние типа добавля­емой к угольному агару лошадиной, овечьей и человеческой крови при выращивании Bord. pertussis в атмосфере СО: по сравнению с обычной воздушной атмосферой. В качестве анти­биотика использовали 40 мкг/мл цефалексина. Показано, что в присутствии СО: среднее число колоний ниже, чем при воз­душной аэрации. То же отмечается и на средах с антибиотика­ми. Присутствие человеческой крови снижает рост на угольном

S6

S7

агаре, но при отсутствии лошадиной или овечьей ее можно ис­пользовать.

Норре J. (1986, 1988, 1989) в кратких обзорах рассматривает
плотные и жидкие среды для выделения, культивирования и
транспортировки Bord. pertussis, а также селективные агенты-ин­
гибиторы микрофлоры носоглотки. Регламентируются пита­
тельные среды и их составные части производства разных фирм.
В качестве транспортной среды предлагается угольный (или аль-
гинатный) агар с кровью. "

HoppeJ., SchwadererJ. (1989) исследовали эффективность ро­ста Bord. pertussis на 4 агаровых средах: на среде для выделения легионелл с 3 мкг/мл линкомицина; на шоколадно-кровяном агаре (с лошадиной кровью) с 40 мкг/мл цефалексина; на шоко-ладно-кровяном агаре с 3 мкг/мл линкомицина и на шоколадном агаре с 3 мкг/мл линкомицина. Значения скорости роста бакте­рий и числа колоний были наиболее высокими на шоколадно-кровяном агаре с цефалексином. На нем во всех экспериментах был получен 100% рост, а фаренгиальная флора почти полностью подавлялась.

Для приготовления корпускулярной коклюшной вакцины Bord. pertussis обычно культивируют в синтетической жидкой среде SS, разработанной Stainer, Scholte (Стейнер-Шолт). Пос­кольку рост культуры и продукция коклюшного токсина повы­шаются при добавлении в среду SS 2-6-0-диметил-р-циклодекст-рина, Wirsing von К. et al. (1988) использовали среду, обогащен­ную этим соединением для выделения Bord. pertussis из клинического материала, полученного из мазков у детей и взрос­лых. Установлена возможность культивирования на этой среде штаммов Bord. pertussis, которые не росли на угольном агаре.

Chan F. et al. (1987) изучали ингибирующее для Bord. pertussis влияние различных концентраций антибиотиков на кровяном угольном агаре, приготовленном из сухого угольного агара («Ох-oid») с цефалексином и среде Борде-Жангу. На первой росли все изученные штаммы (очевидно из-за наличия в ней угольного компонента), а на среде Борде-Жангу—только 20,2%. Показано сходство аминокислотного состава изученных сред.

Норре J., Vogl R. (1986) показали превосходство культивиро­вания Bord. pertussis на угольном агаре («Oxoid»), содержащем 10% дефибринированной лошадиной крови с добавлением и без 40 мг/л цефалексина, в сравнении со средой Борде-Жангу с добавлением 20% дефибринированной крови овец и 40 мг/л це­фалексина, а также модифицированной среды Jones-Kendrick (по скорости роста, количеству выросших штаммов и качеству колоний. Отмечается также свойство всех штаммов Bord. per­tussis сохранять жизнеспособность при 2—8°С в течение 3 не­дель. Для выделения авторы предлагают угольный агар с кро­вью лошади и цефалексином. Угольный или альгинатный агар с лошадиной кровью и цефалексином оказался более эффектив-

ной транспортной системой, чем агар Jones-Kendrick и среда Amies.

Мерцалова Н. У. и соавт. (1987) отмечают зависимость фено-типической выраженности адгезивных свойств Bord. pertussis от питательных сред.

При выращивании коклюшного микроба в промышленных количествах (для производства токсина, необходимого при кон­струировании бесклеточных вакцин) используются, как прави­ло, полусинтетические или полностью синтетические среды (Ап-dron N. et al., 1988). Семина И. Э. и соавт. (1995) изучили влияние подобных сред на уровень синтеза аденилатциклазы коклюшно­го микроба.

Норре J. et al. (1988) выявили низкую эффективность допол­нительного к угольно-кровяному агару с цефалексином исполь­зования аналогичного бульона с 40 мг/л цефалексина для выде­ления Bord. pertussis.

Бакулина Н. А. и соавт. (1980) показали, что наибольшее на­копление бактериоцинов Bord. pertussis при культивировании на жидких средах наблюдается при использовании среды типа Коэ-на-Уиллера с добавлением 0,1% твина-80 и на бульоне Хоттинге-ра с 1 % глюкозы.

По данным Wardlow A. et al. (1976) концентрация магния в среде выращивания влияет на синтез белковых компонентов ко­клюшного микроба, обладающих протективной и гистаминсен-сибилизирующей активностями.

Morrill W. et al. (1987) выделяли Bord. pertussis из назофарин-геальных мазков, хранящихся в транспортной среде Регана-Леве (Regan-Lowe), используя агары Регана-Леве, Борде-Жангу и с циклодекстрином (CD). Количество жизнеспособных Bord. per­tussis, выделенных на агарах Борде-Жангу и CD, составило, соот­ветственно, 90% и менее 70%, выделенных на агаре Регана-Леве.

Шмелева Е. И. и соавт. (1987) изучали кинетику размножения различных штаммов Bord. pertussis в условиях периодического культивирования в шуттелируемых емкостях и в сосудах с прину­дительной аэрацией 6 синтетических и полусинтетических мало­компонентных питательных сред определенного химического состава.

Смирнов В. Д., Сюндюкова Р. А. (1987) оптимизировали ус­ловия выращивания коклюшных бактерий для получения их эк-зоантигенов—гемагглютинина и токсина, являющихся основны­ми компонентами при получении бесклеточной коклюшной вакцины. Культивирование осуществляли в синтетических и по­лусинтетических питательных средах. В качестве стимулятора токсинообразования использовали 2-6-0-диметил-Р-ииклодек-стрин, оптимальная концентрация (0,05—5 мг/л) которого поз­воляет повысить уровень коклюшного токсина до 10—30 мг/л без существенного изменения динамики его образования.

Chazono M. et al. (1992) предлагают культивировать Bord. per­tussis в присутствии целлюлозы и ее дериватов с целью получе­ния одновременно больших количеств коклюшного токсина и филаментозного гемагглютинина для приготовления вакцины.

Необходимым условием успешного проведения экспери­ментов по конструированию рекомбинантной противококлюш-ной вакцины является стандартность и высокое качество пита­тельных сред. За рубежом для культивирования Bord. pertussis разработаны специальные среды, в частности уже упоминавши­еся среды Борде-Жангу, Коэна-Уиллера, Стейнера-Шолта. По экономическим причинам российские исследователи использу­ют в работе среду КУА, имеющую, по исследованиям Степан-шиной В. Н. и соавт. (1994), низкие ростовые свойства и кото­рый непригоден для генно-инженерных работ. Авторы на моде­ли КУА создали плотную питательную среду с белковыми основами, разработанными в ГосНИИ прикл. микробиологии (Оболенск): серно-, солянокислотными и панкреатическим гидролизатами казеина и рыбной муки с сохранением других компонентов. Эффективность перечисленных гидролизатов бы­ла сравнима с гидролизатом казеина фирмы «Difco».

Алексеева Л. Н. и соавт. (1998) разработали сухую среду для выделения Bord. pertussis, содержащую солянокислотный гидро-лизат казеина, дрожжевой экстракт, агар-агар, хлорид и карбонат натрия, крахмал, активированный уголь, амилопектин и обеспе­чивающую интенсивный рост данного микроорганизма.

Halperin S. et al. (1992) использовали.тля выделения Bord. per­tussis фосфатный буфер с гидролизатом казеина.

Ваксман А. Н., Шильман С. Д. (1967) рассматривают методи­ческие вопросы использования картофельно-глицеринового, молочно-кровяного и казеиново-угольного агаров для выделе­ния коклюшного и паракоклюшного микробов.

Kurzynski Т. et al. (1988) установили примерно одинаковую эффективность модифицированных сред Борде-Жангу и агара Регана-Леве с цефалексином и анизамицином для выделения коклюшных и паракоклюшных микробов из клинического мате­риала (назофаренгиальных тампонов). Максимальная чувстви­тельность анализа достигалась при параллельном культивирова­нии в обеих средах.

Gorringe A. et al. (1991) установили, что дефицит железа в ро­стовой среде приводит к появлению у Bord. pertussis и Bord. para­pertussis новых мембранных белков, а также сидерофоров. Пос­ледние обеспечивали перенос ионов железа с трансферрина бак­териальным клеткам.

Farrington (1977) использовал агар МакКонки, содержавший фуралтадон и нистатин (среда G20), для изоляции бордетелл из носовых мазков.

По данным Smith I., Baskerville A. (1979) агар МакКонки и среда G20 показывают хорошие результаты при относительно

высокой численности бордетелл. Исследовались носовые мазки у молодых свиней. При использовании среды G20G, базирую­щейся на пептоннном агаре с добавлением пенициллина, фурал-тадона и гентамицина, бордетеллы изолировались у 50% свиней в возрасте 1—12 недель.

Quentin-Millet M.-J. et al. (1990) запатентовали питательную среду для бордетелл, содержащую циклодекстрин или соль дек-страна в сочетании с этерифицированным производным D-глю-козы с молекулярной массой не менее 2 кД.

Arp L. (1986) изучал влияние питательной среды на сцепле­ние Bord. avium со слизистой трахеи.

При изучении клеточных жирных кислот Moore С. et al. (1987) выращивали Bord. avium и Bord. bronchiseptica на сердеч­но-мозговом агаре добавлением 5% бараньей крови в атмосфере 5% С0₂ 16 ч при 37°С.

Fuzi M. (1975) рекомендует добавлять в среду для изоляции Bord. bronchiseptica нитрофурантин, к которому большинство грамотрицательных бактерий высокочувствительны.

Elias В., Galgoczi В. (1981) считают необходимым при изоля­ции Bord. broncSiseptica из носовых мазков у свиней вводить в агар МакКонки дополнительно пенициллин и нитрофурантин. Elias В. (1987) рекомендует при изготовлении вакцины против атрофического ринита и воспаления легких свиней, вызванного Bordetella и Pasteurella, культивировать бордетелы вначале на плотной, а затем в жидкой питательных средах.

Hommez J. et al. (1984) показали эффективность использова­ния цефалексина в селективной среде для изоляции Bord. bron­chiseptica из носовых мазков и посмертного материала, хотя луч­шие результаты были получены при добавлении в среду пени­циллина и фуралтадона.

Татаринцев Н. Т., Кожевников С. В. (1993) при диагностике пневмонии свиней бордетеллезной этиологии посевы образцов на Bord. bronchiseptica осуществляли на следующие обогащен­ные среды: КУА. среда Гартоха, агар МакКонки и кровяной агар.

Миланко А. Я. и соавт. (1996) использовали для первичной изоляции, помимо указанных сред, также агар МакКонки с 1% декстрозы, лактозно-сахарный агар и др.

Vidic В. et al. (1993) культивировали Bord. bronchiseptica на следующих плотных средах: агары кровяной; МакКонки, содер­жащий 1% декстрозы; Эндо; триптон-соевый; пептонный; Бор­де-Жангу. древесно-угольный и FC. Последний содержал 10 г/л пептона; 10 г/л лактозы; 10 г/л глюкозы; 3 г/л мясного экстрак­та; 1,5 г/л желчных солей; 5 г/л NaCl и 6,6 мл/л 0,2%-ого фено­лового красного: рН-7,4. Была исследована чувствительность Bord. bronchiseptica к следующим антибиотикам и терапевтиче­ским агентам: пенициллин, линкомицин, нитрофурантин, бифу-рал, цепорекс, стрептомицин, ампивет, спесийномицин. гриме -тозол, тилан, гентамицин, флубактин, тетрациклин, хлорамфе-

никол. Исходя из полученных результатов конструировались на базе перечисленных сред рецептуры с включением тех или иных антибиотиков и их комбинаций. Наилучшие результаты получе­ны при использовании кровяного и FC-агаров, содержащих пе­нициллин с цепорексом или нитрофурантином (68—69,4%). Другие среды и сочетания антимикробных препаратов также об­ладали удовлетворительной селективностью. Среди безингиби-торных сред агары МакКонки и Эндо были наиболее селектив­ными.

Frohlich В. et al. (1995) показали, что ионный состав и общая ионная концентрация ростовой среды являются важными фак­торами лимитирования продуктивности в аэрируемых реакто­рах, используемых для продукции коклюшного токсина и дру­гих антигенов Bord. pertussis. Концентрация солей отрицательно влияла на клеточный рост дикого типа Bord. pertussis формиро­вание специфического токсина. Концентрация ионов натрия ниже 140 мМ коррелировала со снижением преципитации в спе­цифическом выходе коклюшного токсина и иначе-с выходом ростассоциированного продукта. Высокие концентрации соли в среде приводили к снижению конечных концентраций клеток, но не воздействовали на начальную скорость роста. Предполага­лось, что новая среда позволит увеличить на 60—70% выход как клеток, так и токсина благодаря замене хлорида натрия в цикло-декстриновой жидкой (cyclodextrin liquid—CL) среде и дополни­тельно введенному мононатрия глутамату, который служит ис­точником натрия, углерода и энергии.

Дата добавления: 2015-07-08