Сыворотка крови животных и человека

Сыворотка крови богата биологически активными соединени­ями, значение многих из которых в отношении микроорганизмов неясно. Она является также одним из источников железа, необхо­димого для многих видов бактерий. Особенности сыворотки крови разных видов животных и человека хорошо изучены. Показаны различия в белковом составе (Кармолиев Р. X., 1971) и других био­химических свойствах (Радаева И. Ф., Костина Г. А, 1998). При культивировании микобактерий для обогащения жидких питатель­ных сред используют сыворотку крови различных видов млекопи­тающих. В нативном состоянии ее рекомендуют включать в среду для культивирования L—форм микобактерий туберкулеза Дорож-кова И. Р., Волк А. В. (1972) и Мордовской Г. Г., Птицына Е. А. (1982). По данным Mysak J. (1974) среда Банич с добавлением 10% сыворотки крови превосходит по культуральным свойствам среды

Левенштейна-Иенсена и Шула. Максимальное улучшение культу-ральных свойств жидких питательных сред отмечается при исполь­зовании крови (Dickinson J. et al., 1989) и сыворотки крови крупно­го рогатого скота (КРС) или V фракции бычьего сывороточного альбумина (БСА). Это среда Школьниковой с 10% сыворотки кро­ви КРС и среда Миддлбрука (Middlebrook) без агара, но с добавле­нием комплекса олеин-альбумин-декстроза-каталаза. Хранение коммерческих сред, содержащих V фракцию БСА, ухудшает их культуральные свойства (Culter S., 1988). Бибергаль В. А. (1991) по­казала улучшение культуральных свойств среды Школьниковой в 9 раз при добавлении свежей человеческой плазмы. Можно, по ее мнению, использовать для этого и инактивированную сыворотку крови КРС. По данным Ильиных Л. А. (1990) при добавлении сы­воротки крови КРС в среду Гельберга отмечается более ранний и интенсивный рост колоний микобактерий. Свежая сыворотка кро­ви КРС в среде Middlebrook 7H11 ускоряла рост М. bovis (Galaciner J., Horwill D., 1977). Сыворотку крови КРС содержит среда Ренжа-ра для культивирования М. paratuberculosis (цит. по Сидорову М. А. и соавт., 1995). Среду для выделения микобактерий, содержащую сыворотку крови лошади, предлагают Дудницкий И. А. и соавт. (1991). Dhople A. et al. (1996) отмечают стимулирующий эффект на рост М. avium добавления в бульон 7Н9 сыворотки крови кроликов и людей, больных гемолитической анемией и гемохроматозом; то­гда как сыворотки крови здоровых людей и больных микобактери-озом, вызванным М. avium, наоборот, оказывали угнетающее дей­ствие. Сыворотка крови лошади входит в состав среды ML для культивирования М. leprae (Osawa N., 1997). Среда VS3E, содержа­щая 30% сыворотки крови плода коровы (Bhatia V., Rao S., 1989), поддерживает рост М. leprae.

Нативную сыворотку крови лошади используют в питатель­ных средах для пневмококков Балаян Л. Б. (1947); Бухарин О. В. и соавт. (1981).

Сыворотка крови входит в состав сред для нейссерий (Лабин-ская А. С, 1972; ГаджиеваА. Г. и соавт, 1982), в том числе менин­гококков (Руководство..., 1973; Шичкина В. П. и соавт., 1983). Общепринято выделение и культивирование последних на ага­ровых средах с 20% сыворотки крови лошади (Игонина Ю. А. и соавт., 1976; Костюкова Н. Н. и соавт., 1980). Используется и сы­воротка крови КРС (авт. свид-во № 1659485, 1991). Учитывая процентное соотношение белков в асците, Андреева 3. М., Боб-ровникова А. Я. (1984) заменили его в соответствующих пита­тельных средах для нейссерий сывороткой крови лошади. При этом, как отмечалось выше, ростовой эффект 1%-ой сыворотки объяснялся нейтрализацией ею токсического компонента агара. Шичкина В. П. и соавт. (1983) вводили в среду 13—20% сыворот­ки крови животных. Татарников В. М. и соавт. (1984) показали низкую высеваемость менингококка на среде Гаджиевой в срав­нении с 20%-ым сывороточным агаром Хоттингера и рекоменду-

ют добавлять в среду 10% нативной сыворотки крови лошади.

Османова М. М. и соавт. (1987) на жидких средах с разным со­держанием сыворотки крови КРС показали защитный и стимули­рующий механизм действия ее на рост гонококков. В результате оптимизации процесса культивирования получен рост тест-штам­мов в бессывороточных средах. N. meningitidis формируют поли-сахаридную капсулу на плотных средах с добавлением нативной сыворотки, белки которой, однако, являясь балластными приме­сями, затрудняют процессы выделения и очистки препаратов, со­держащих капсульный полисахарид. Скляр Т. В. и соавт. (1997) считают возможным замену в среде для культивирования N. gon­orrhoeae сыворотки крови КРС на плазмол. Сыворотка крови че­ловека и животных улучшает рост бледных трепонем. По данным Tokahashi К. et al. (1987) сыворотки крови человека и свиней инги-бируют активность гемолизина Т. hyodysenteriae.

Сыворотка крови млекопитающих удовлетворяет пищевые потребности большей части патогенных видов микоплазм в про­теине, стероле, фосфолипиде и ацетонрастворимом липиде (Ка­ган Г. Я., Раковская И. В., 1968). Наиболее широко используют­ся для культивирования среды, обогащенные нативной сыворот­кой лошади. Выявленную непригодность сыворотки крови КРС Башмакова И. А., Солдатова В. М. (1971) связывают с низким со­держанием в ней холестеринов и липидов. Кроме того, по их дан­ным сыворотка крови человека эффективнее для выделения ми­коплазм.

Сыворотка крови лошади используется в среде для выделе­ния Ureaplasma urealyticum (Гаджиева Г. Р. и соавт., 1989) и в среде U-9 (Raddi M. et al., 1992). Ее содержание в средах для микоплазм колеблется от 5 до 20% (Зуев В. В., 1971; Жеверже-ева И. В. и соавт., 1983; Барышникова П. И., 1994; Sikdar A. et al., 1992).

Ferreira N. (1993) допускает при инкубации М. gallisepticum на средах ТР и SS замену лошадиной сыворотки крови свиной, хотя 1-ая для дифференциации штаммов и анализа белков в ЭПАГ оказалась предпочтительней. Билько И. П. (1975) рассма­тривает использование сыворотки крови в питательных средах для получения биомассы микоплазм как отрицательное явление, вследствие необходимости многократного отмывания и концен­трирования ее для освобождения от белков сыворотки. Эффек­тивной для выделения гемокультур микоплазм оказалась среда Клодницкого с 0,01 %-ым цистином без добавления сыворотки крови животных (Клодницкая С. Н., 1976). О возможности куль­тивирования М. canadense и М. verecundum в питательной среде для микоплазм без сыворотки, но с БСА, сообщают Graciela M., Sotomayor P. (1990), хотя интенсивность роста при этом была ни­же. Breard A. (1990) рекомендует синтетический заменитель сы­воротки крови при молекулярно-биологических исследованиях, но не для получения антигенов у микоплазм. По данным Okasa-

ki N., Fujiwara K. (1992) отдельные виды микоплазм чувствитель­ны к микоплазмоцидному действию сыворотки крови лошади. Наибольшая активность выявлена по отношению к М. pneumo­niae. Эффект проявлялся при 37°С в присутствии Са²⁺ и Mg²⁺. После прогревания при 56°С в присутствии комплемента эффект сохранялся в отношении М. pneumoniae и М. fermentans, но не в отношении М. neurolyticum и М. laidlawii. Установлено, что эта активность определяется комлексом lg G и М.

Сыворотка кроличьей крови в концентрации 5—30% является основным компонентом питательных сред для лептоспир. Мала­хов Ю. А. (1992) рекомендует использовать для их культивирова­ния сыворотку крови животных только двух видов: кроликов и овец. Сыворотки крови КРС, баранов, лошадей и свиней облада­ют бактерицидным действием по отношению к лептоспирам (Ананьина Ю. В., Чернуха Ю. Г., 1983; 1984). Наиболее активно росту этих микроорганизмов способствует альбуминовая фрак­ция. Некоторые исследователи рекомендуют использовать гемо-лизированную сыворотку, отмечая улучшение роста лептоспир при определенной степени гемолиза. Сыворотка крови или альбу­мин используются для детоксикации твинов в питательной среде.

Первоначально в нашей стране при промышленном произ­водстве вакцины против лептоспироза микроорганизмы культи­вировали в среде Уленгута, состоящей из воды и кроличьей сыво­ротки крови. Замена в дальнейшем этой сыворотки на овечью не снизила качества вакцины. Однако переход в 1966 году биофаб­рики на альбуминовую среду ВГНКИ-1, где сыворотка была за­менена ее альбуминовой фракцией вызвал ухудшение антиген­ных свойств лептоспир и с 1975—1976 годов для культивирова­ния вновь стали использовать водно-сывороточную среду с овечьей сывороткой. Затем было установлено отрицательное влияние на рост лептоспир спонтанно встречающихся в сыво­ротках крови овец-доноров гомологичных антител и на биофаб­рике внедрили комбинированную сывороточно-альбуминовую среду, которую применяют и в настоящее время (Ситьков В. И. и соавт., 1996). За рубежом же для этих целей используют бессыво­роточные полусинтетические (альбуминовые) или синтетиче­ские питательные среды.

Сыворотку крови различных видов млекопитающих добавля­ют в среды для спорификации патогенных и непатогенных микро­бов (Sementini А., 1942), в частности, В. anthracis (Srinivasan V. et al., 1972). Кровь и ее сыворотка адсорбируют ингибиторы капсу-лообразования питательной среды (Schaefer W., 1963). Роль пос­ледней в образовании капсул у вирулентных штаммов В. anthracis изучали Meynell E., Meynell G. (1964). Нативные бычья или лоша­диная сыворотки в относительно высокой концентрации являют­ся обязательными компонентами многих элективных сред, пред­назначенных для капсулообразования В. anthracis (ГКИ; Томова; Шляхова, 1973; Низамова Р. Н. и соавт., 1992; Лефлера; сыворо-

точных агара и бульона). Левина Е. Н. и соавт. (1974) с целью на­копления токсина В. cereus использовали среду Торна с добавле­нием, помимо других компонентов, 1% сыворотки крови.

Кровь КРС, а чаще ее сыворотка, входят в состав питатель­ных сред для культивирования бруцелл (Колесникова Н. С, 1961; Альтон Дж., Джонс Л., 1968). Как заменитель сыворотки для повышения ростовых качеств среды для бруцелл используют твин-40. В отличие от других (шероховатых форм) бруцелл штамм Br. ovis И-65 (гладкий вариант) растет только на питатель­ных средах с нативными сыворотками крови КРС или лошади (Тарасова Т. А. и соавт., 1983).

Для культивирования Campylobacter pylori используют раз­личные кровяные среды с добавлением 5—10% бараньей, лоша­диной или человеческой крови и (или) сыворотки (Баженов Л. Г., 1991). Xia H. et al. (1992, 1993) отмечают, что в сердечно-мозговом бульоне с 10% лошадиной сыворотки крови С. pylori сохраняют­ся более 3 сут. Schulze E et al. (1987) выделяли и дифференциро­вали бактерии рода Campylobacter на агаре Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton) с добавлением 10% телячьей крови.

Allan Е., Poxton 1. (1994) показали влияние среды культивиро­вания на чувствительность различных видов Bacteroides к бакте­рицидному действию комплемента сыворотки крови человека и экспрессию поверхностных структур. Изученные штаммы были в различной степени чувствительны к сыворотке когда культиви­ровались в обогащенной среде с протеозным пептоно-дрожже-вым экстрактом. Однако при выращивании в минимальной сре­де Van Tassell и Wilkins, половина штаммов проявляла ощутимую устойчивость как к человеческой, так и к инактивированной ба­раньей сывороткам крови.

Для культивирования возбудителя американского гнильца пчел (Вас. larvae) в настоящее время широко используют МПА с добавлением 10% лошадиной сыворотки крови без консерванта, хотя и на ней Вас. larvae не всегда хорошо растет.

Савельев Е. П. и соавт. (1989) изучали влияние на рост стреп­тококков группы А добавления в среду культивирования фракций сыворотки крови КРС, содержащих низкомолекулярные соедине­ния. Griffiths В., McClain О. (1987) показали восстановление инга-бированной ионами Fe³⁺ продукции гемолизинов Str. pyogenes при добавлении в среду сыворотки. По данным Shimokawa О. et al. (1994) сыворотка крови лошади подавляет рост L-форм St. aureus, а редкие колонии, выраставшие на среде, обогащенной данной сывороткой, являются стабильными L-формами. Ivanova E. et al. (1991) культивировали стабильные L-формы протопластов Е. coli WE⁺ на соевой среде с 10% сыворотки.

По данным Evans M. et al. (1986) добавление сыворотки кро­ви человека к бульону Мюллера-Хинтона приводит к появлению 14—50% ложноположительных результатов чувствительности Ps. aeruginosa к моксалактаму. Значительно возрастает чувствитель-

I⁷

ность Ps. aeruginosa к сыворотке крови человека при выращива­нии на Mg-дефицитной среде (Tzouvelekis L. et al., 1990).

Кравцов А. Н. и соавт. (1987, 1992) показали связь остановки роста Y. pestis в нативной сыворотке крови с ограничением посту­пления железа в микробную клетку. Выяснено, что гемин Y. pestis в сыворотке не используют. Предполагается ассимиляция железа трансферрина зависящая от температуры и осуществляющаяся только при 28°С. Инкубация в сыворотке крови человека способ­ствует обогащению антигенной структуры возбудителя чумы, по­вышая тем самым вирулентность и иммуногенность.

Пастереллы на средах без сыворотки растут не всегда удовле­творительно, поэтому в бактериологической диагностике пасте-реллеза рекомендуется использование сывороточных МПА и МПБ, а также сывороточных бульона и агара Хоттингера в состав которых входят 10% нативной сыворотки крови лошади (Метод, указания..., 1992).

Наличие цистиназы—основного видового признака С. dipt-heriae—определяют на среде Пизу с 10% лошадиной сыворотки. Батурина А. В. и соавт. (1990) заменили в ней лошадиную сыво­ротку на среду 199. Отсутствие сыворотки крови в агаровой сре­де не сказывается на качестве тестирования токсигенности диф­терийных культур, причем наилучшей из заменителей сыворотки (твин-40, ГЛА, аминопептид, протеин) оказалась среда 199 (Гази-зова Г. Р. и соавт., 1990).

Сидоров М. А. и соавт. (1995) отмечают лучший рост актино-мицетов A. pyogenes и A. hardeovulneris на сывороточных средах. Сыворотка крови кролика входит также в состав среды Бейгтона, Колмана (1976).

Пушкарева В. И. и соавт. (1997) показали реверсию покоя­щихся листерий в вегетативное состояние под воздействием фе-тальной сыворотки.

Castaneda E. et al. (1988) отмечают эффективность наличия в среде культивирования лошадиной сыворотки крови при выде­лении Paracoccidioides brasiliensis и объясняют это содержанием в ней сидерофоров.

Поданным Ожередовой Н. А. (1997) стимулирующий эффект сыворотки крови рыб на рост и размножение С. albicans выше, чем кроличьей.

1.5. Твины

Твины—это детергенты (поверхностно-активные вещества, которые, расщепляя молекулы белка или жира на различные со­единения, проникают в жировую и казеиновую пленки). В не­больших концентрациях твины обеспечивают рост культур мик­роорганизмов не изменяя их морфологических и биологических свойств (Карташова В. М., 1973). В то же время, имеются данные

о специфических изменениях в структуре клеточных стенок и цитоллазматических мембран у L. monocytogenes, Sal. typhimuri-um, Ps. aeruginosa и Ps. pseudomallei при обработке их 0,5 и 1% твин-20 (Cherepova N., Veljanov D., 1994).

Бруцеллы разных видов способны гидролизовать твины (Ры­кова В. И., Домарадский И. В., 1963) и в качестве компонентов питательных сред для их выращивания рекомендуются твин-40 (АльтонДж., Джонс Л., 1968),твин-60(ГрушинаТ. А., 1975, 1978) и твин-80 (Бакулов И. А. и соавт., 1993) с целью замены сыворот­ки и повышения ростовых качеств сред.

Крылова М. Д. (1969, 1972) при культивировании Corynebacte-rium diptheria добавляла к мартеновскому бульону 0,02% твина-80. Collins (1986) рассматривает способность к гидролизу твина-80 у С. cystitidis как признак, позволяющий дифференцировать его от С. renale и С. pilosum, которые такой способностью не обладают.

Бузолева Л. С, Пручкина 3. В. (1990) для выявления липазы у бактерий кишечной группы (шигелл и сальмонелл) после пред­варительного засева в различные среды богатые органическими веществами, вторым этапом высевали инокулят на плотные ага­ровые среды с твинами-20, -40 и -60, являющиеся субстратами биохимических реакций, лежащих в основе определения липазы бактерий. Показано значительное снижение активности липазы с увеличением концентрации твинов. Авторы предполагают, что увеличение содержания твина в реакционной среде резко снижа­ет эффективность процесса гидролиза.

По данным Akbulut N. et al. (1994) для выделения и диффе­ренциации Y. enterocolitica агар МакКонки модифицированный с твином-80 оказштся эффективнее сред МакКонки: SS; висмут-сульфитной с бриллиантовым зеленым; желчной с фиолетовым красным и дезоксихолатной.

Аэробный питательный агар-среда для Bacteroides fragilis (Петраков А. А., 1982) содержит твин-80. Для упрощения проце­дуры выделения Вас. fragilis предлагается готовить среды на ос­нове сухой среды для контроля стерильности производства ЦНИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва) с до­бавками гемина, витамина К, твина и др. (Петраков А. А., 1982; Баженов Л. Г., Исхакова X. И., 1985).

Большинство видов рода Serratia (энтеробактерии) способны гидролизовать твин-80, исключение составляет Sen odorifera.

Твин-80 входит в состав жидкой синтетической среды № 7 для выделения микобактерий туберкулеза из патологического материа­ла (Bernhardt С, Rentgen H.. 1975). Для их культивирования и фаго-типирования Garcia-Rodriguez J. et al. (1986) эффективно использо­вали среду RVB с твином-80. Между тем, еще в 1953 году Bloch и Noll показали слабовирулентность микобактерий туберкулеза, вы­ращенных на среде с твином-80, и восстановление вирулентности при пересеве на среды без него (цит. по Кравченко М. А., 1984). В средах с твином-80 с потерей гидрофобности наблюдается диффуз-

ный рост микобактерий (Сидоров М. А. и соавт., 1995). Способ­ность к гидролизу твина позволяет дифференцировать отдельные виды микобактерий (Lawrence, Kubica, 1986). Кроме того, твин-80 ингибирует рост микобактерий (Thomas С. et al., 1989). По данным Masaki S. et al. (1990, 1991) 0,05% (0,5 мг/мл) или более твина в жид­кой среде оказывает бактериостатическое действие, приводит к уд­линению клеток М. avium, уменьшает содержание в них гликоли-пидов, а также изменяет результаты биохимических тестов на ре-дуктазу нитратов, уреазу и арилсульфатазу. В то же время, твин-80 и аналогичные ему сурфактанты потенцируют действие антибиоти­ков на М. avium, что объясняется действием его непосредственно на клеточную стенку данного микроорганизма. Шим Н. В. и соавт. (1989) рассматривают твин-80 как агент, вызывающий L-трансфор-мацию микобактериальных клеток.

Признаком, дифференцирующим Erysipelothrix rhusiopathie (возбудителя рожи свиней и эризипелоида людей) от бактерий сходных родов, является неспособность к гидролизу твинов-20 и -80, тогда как листерии их гидролизуют, а у коринебактерий, лак-тобацилл и др. этот признак не определялся (Сидоров М. А. и со­авт., 1995).

Твин-80 входит в состав сред Рогоза и МРС—для культивиро­вания Lactobacillus; среды Бриге в модификации Шарп—для культивирования Pediococcus и среды для определения псевдока-талазы (ГОСТ 1044.11-89).

Из ряда сред использованных Lorenzini R., Bernardis F. (1987) для культивирования, идентификации и сохранения грибов Malassezia pachydermatis наиболее пригодным оказался сахарный агар, обогащенный 1,5% дрожжевого экстракта и 1% твина-80. Предложена среда для идентификации Candida albicans и Crypto-coccus neoformans, содержащая твин-80 и желчь (J. Clin. Microbi­ol., 1977, v. 5, p. 236—243). При сравнительном изучении 4 пита­тельных сред Kurup V. et al. (1986) установили, что для получения бластоспор из мицеальной формы возбудителя североамерикан­ского бластомикоза (Blastomyces dermatitidis) наиболее пригодна альбумино-казеиновая среда с твином, на которой обнаружива­ли характерные клетки с единичными почками. Waller J. et al. (1991) для поиска хламидоспор С. albicans производили посев на агаризованную среду с твином-80.

Волина Ё. Г. и соавт. (1982) изучали динамику формирования колоний лептоспир на средах, содержащих твин-80. Один из наиболее эффективных и экономически доступных источников жирных кислот, необходимых лептоспирам,—водорастворимые липиды. Из последних предпочтительны полисорбаты, к кото­рым относятся твины 20—80—эфиры соответствующих жирных кислот. Содержание последних в них следующее (%):

твин-80: олеиновая кислота—64,45; линолевая—21,86; паль­митиновая—7,64; пальмитоолеиновая—1,89; стеариновая—1,44 и линоленовая—0,68;

твин-60: стеариновая кислота—64,26; пальмитиновая—33,96; гептодекановая—1,58; миристиновая—0,84 и арахиновая—0,14;

твин-40: пальмитиновая кислота—94,77; стеариновая—2,88; миристиновая—1,68; каприловая—0,125; лауриновая—0,126 и пентадекановая—0,229;

твин-20: лауриновая кислота—55,16; миристиновая—24,26; пальмитиновая—9,46; каприновая—4,65; каприловая—3,88 и стеариновая—1,23 (Ellinghausen, 1983).

Однако твины содержат определенное количество свободных жирных кислот (твин-80—до 3%), токсичных для лептоспир. Простейший способ их детоксикации—добавление к среде сыво­ротки крови или альбумина в обычных концентрациях или со­единение твина с мелким порошком древесного угля, который хорошо адсорбирует все токсические примеси.

Оптимальная концентрация твина-60 в сложной среде соста­вляет 200—300 мкг/л; для смеси твина-60 и твина-80 концентра­ция каждого компонента равняется соответственно 200 и 50 мкг/мл.

Для культивирования лептоспир предложены твин-альбуми-новые среды Ellinghausen, McCullogh в модификации Johnson, Harris (1967) и Russel E, Russel С. (1986), а также твин-альбумин-сывороточная среда Эллиса для выделения L. interrogans и усо­вершенствованная элективная среда для выделения лептоспир из контаминированного материала (Adler В. et al., 1986).

Белоусов В. И., Тюрина И. Н. (1996) показали возможность выращивания производственных штаммов лептоспир на твин-альбуминовой среде с использованием отечественных компо­нентов. Очищенный на ионообменной колонке отечественный твин-80 по качеству превосходил таковой фирмы «Merck». При промышленном культивировании оказался годным и неочищен­ный твин, но для его детоксикации на 0,25% в среду необходимо было добавлять не менее 0,2% альбумина.

Из жидких сред наиболее эффективной для накопления бак-териоцинов Bord. pertussis оказалась по данным Бакулиной Н. А. и соавт. (1980) среда типа Коэн-Уилера с добавлением 0,1% тви­на-80.

Kelly M. et al. (1988) провели комплексное двухэтапное иссле­дование по оценке 4 сред для выделения шт. Aeromonas из фека­лий, в том числе агара МакКонки, содержащего 100 мкг/мл ам­пициллина и 1% твина-80.

Дата добавления: 2015-07-08