Грамотрицательные аэробы 2. 1. Род псевдомонады

К роду Pseudomonas относятся 18 видов (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. cepacia, Ps. mallei, Ps. pseudomallei, Ps. fic-ketti, Ps. stutzeri и др.), которые могут вызвать тяжелые формы инфекций как внутрибольничных, так и ятрогенных типов. Наибольшую важность для медицины и ветеринарии пред­ставляют Ps. aeruginosa, Ps. mallei и Ps. pseudomallei. Эти микроорганизмы неприхотливы по питательным потребно­стям и способны выживать в условиях окружающей среды (Hansen W., 1991). Ps. aeruginosa сохраняет жизнеспособность почти при полном отсутствии источников питания (Toth D. et al., 1983).

Физиология, биохимия и родо-видовые дифференциально-диагностические признаки псевдомонад обобщенно представ­лены в работах Palleroni (1984), Рубан Е. Л. (1986), Мороз А. Ф. и соавт. (1988), Белякова В. Д. и соавт. (1990), Смирнова В. В., Киприановой Е. А. (1990). Достаточно успешными оказались попытки использования с диагностической целью способно­сти псевдомонад ассимилировать отдельные органические ве­щества. В результате спектры углеродного питания также эф­фективно применяются при идентификации, как и «пестрые ряды» для энтеробактерий (Смирнов В. В., Киприанова Е. А. (1990).

Отмечается бесперспективность разработки универсальных сред на основе антибиотиков и красителей для селективного выделения псевдомонад и быстрой их дифференциации от дру­гих грамотрицательных бактерий, так как диапазон видовой чувствительности псевдомонад к этим агентам очень широк (Смирнов В. В., Киприанова Е. А., 1990). По этой же причине выражается сомнение в пригодности подобных сред, уже раз­работанных Grant M., Holt J. (1977), Wakisaka Y., Koizumi К. (1982).

Между тем, большие возможности в плане создания уни­версальных сред открывает использование ЭДТА и солей ба­рия, избирательно подавляющих различные виды Pseu­domonas, независимо от чувствительности их к антибиотикам и красителям.

До сих пор не существует строго регламентированного набо­ра тестов для идентификации Ps. aeruginosa. Как не утративший способности к сапрофитизму, он характеризуется выраженной биохимической активностью, обладает необходимым для дыха­ния набором ферментов, восстанавливает нитраты в нитриты, редуцируя их до газообразного азота, хотя последний тест, по данным Girardi G (1980) может быть отрицательным у 42% штаммов. Характерным биологическим признаком Ps. aerugi-

Ч

nosa, значительно упрощающим идентификацию приблизитель­но 70—80% штаммов, является уникальная способность синтези­ровать водорастворимый феназиновый пигмент—пиоцианин, окрашивающий питательную среду в синезеленый цвет. Кроме того, большинство культур образует зеленый, флуоресцирующий в Уф лучах, пигмент флуоресцеин или пиовердин, а также другие пигменты (пиорубин, пиомеланин, аоксифеназин). В некоторых случаях выявляются атипичные беспигментные (8—18%) или слабопигментированные формы (Мороз А. Ф. и соавт., 1988), что объясняется действием сопутствующей микрофлоры, антибио­тиков, недостатком кислорода. Имеется основание считать мела-нинобразующие штаммы более патогенными (Рожавин М. А., 1983).

Уникальным свойством Ps. aeruginosa является способность образования на плотных средах блестящего металлического налета (само название «aeruginosa» означает «покрытая нале­том цвета медной ржавчины»). Однако это свойство встречает­ся нестабильно у всех штаммов данного вида и Калина Г. П. (1984) подробно анализирует литературу о влиянии на выявле­ние этого признака состава среды культивирования. Автор экс­периментально проверил многочисленные комбинации раз­личных компонентов, используемых в средах (триптон «Difco», глицерин, сульфат калия, хлорид магния, нитрат калия, арги­нин, аспарагин, молоко), а также непосредственно среды для интенсификации блеска (МПА с 5% человеческой крови, сре­да с хлоридом N-цетилпиридиния, трехсахарный железный агар, две среды Берка: повышенной питательности за счет уве­личения содержания триптона и с меньшим содержанием пос­леднего, но с введением в состав аргинина). В результате раз­работана среда, содержащая МПА с повышенной концентра­цией пептона, молоко, 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлорид и L-аргинина монохлорид, на которой Ps. aeruginosa, за еди­ничными исключениями, образует металлический блеск высо­кой интенсивности. На практике можно упростить среду заме­нив МПА сухим порошковым агаром и исключив пептон, ар­гинин.

Идентификация беспигментных и слабопигментных штам­мов Ps. aeruginosa может быть упрощена использованием сред, предложенных King E. (1954) для усиления образования пиоциа-нина (среда Кинга А) и флуоресцеина (среда Кинга В), а также сред Калиной Г. П. (1984) и Daly J. et al. (1984).

Ps. aeruginosa хорошо растет и размножается на простых пи­тательных средах в аэробных условиях при 30—37°С и сохраняет эти свойства при 42°С. На поверхности питательного бульона или пептонной воды культуры образуют серовато-серебристую пленку. На МПА, средах Эндо или Плоскирева различают 5 ти­пов колоний: плоские неправильной формы, типа Е. coli, склад­чатые, слизистые и карликовые.

Ps. aeruginosa обладает слабой сахаролитической активно­стью и получает энергию путем окисления самых разнообраз­ных субстратов-сахаров и других углеводов. Окисление одного и того же вещества может происходить по разному в зависимо­сти от условий, при этом гликолиз и цикл Кребса не являются единственными механизмами биохимического превращения углеводов. Глюкоза может окисляться до 2-кетоглюконовой ки­слоты без образования газа в аэробных условиях, тогда как в анаэробных ферментации глюкозы вообще не происходит. При длительной (2—3 сут) инкубации все штаммы окисляют ксило­зу, арабинозу, маннозу (Анохина Р. В., 1973) и выявляют ос-га-лактозидазу (Исхакова X. И., 1980). Возбудитель инертен к лак­тозе, сахарозе, манниту, мальтозе (Lanyi В., 1968) и индолотри-цателен (Исхакова X. И., 1980). Протеолитические свойства, наоборот, хорошо выражены: разжижение желатина, свернутой кровяной сыворотки, гидролиз казеина. Родовым признаком является синтез цитохромоксидазы. Цитохромоксидазная про­ба—достаточно надежный тест для идентификации штаммов Ps. aeruginosa. Этот микроб синтезирует триметиламин, прида­ющий культурам своеобразный запах, напоминающий жасмин, земляничное мыло или карамель.

В качестве таксономического для Ps. aeruginosa признака До-марадский И. В. (1975) рассматривает феномен радужного лизи­са при росте на плотных средах.

Нетребовательность к питательным веществам дает возмож­ность изолировать его на любых достаточно простых жидких и плотных средах. Однако, являясь ведущим возбудителем в пато­логическом материале, Ps. aeruginosa довольно часто находится в ассоциации с другими микроорганизмами, поэтому для его од­ноступенчатого выделения используется целый ряд элективных и дифференциально-диагностических сред. Они должны содер­жать химические соединения, являющиеся либо источником пи­тания только для синегнойной палочки, либо подавляющие рост ассоциативной микрофлоры, не задерживая при этом ее собст­венный рост.

К 1-ому типу можно отнести среды с ацетамидом(Буль С. М., Колкер И. И., 1978; Hedberg М., 1969; Mossel D. et al., 1976), ко­торый используется Ps. aeruginosa в качестве источника азота и углерода, в отличие от других грамотрицателъных микроорганиз­мов и остальных видов рода Pseudomonas. Hedberg M. et al. (1969) рекомендуют для выделения из мочи и отделяемого гнойных ран среду Симмонса с заменой цитрата натрия на ацетамид (2%), по­скольку на ней полностью подавляется рост культур протея. В то же время, Шеина Э. П., Арутчева А. А. (1979) вновь предлагают выделять Ps. aeruginosa из ассоциации с протеем просто на среде Симмонса.

Korth S. (1963) предложил хинно-кислую среду для иден­тификации Ps. aeruginosa и Ps. fluorescens, исходя из способно­сти их использовать хинную кислоту в качестве источника уг­лерода.

Однако большинство разработок селективных сред ориен­тировано на химические соединения, ингибирующие рост бак­терий- ассоциантов Ps. aeruginosa. В связи с резистентностью к нитрофурановым препаратам для его выделения предложены питательные среды, в состав которых вводится одно из соеди­нений названной группы (Черномордик А. Б., 1971; Carlevaro С. et al., 1963; Thom A. et al., 1971). Наибольшее распростране­ние за ру-бежом получили сухие среды, содержащие в качестве селективного агента цетилтриметиламмоний бромид или цет-римид (Aldridge С. et al., 1964; Brown V, Lowbury E., 1965; Mos-sel D. et al., 1976; Negretti E, Trabattoni C, 1984), 2, 4, 4-три-хлоро-2-гидроксифеноловый эфир или иргазан (Robin Т., Jan-da M., 1984).

В нашей стране для одноступенчатого выделения Ps. aeruginosa предложены среды: синтетическая с фурагином (Ароне Р. М., Чур­сина Т. В., 1975), накопительная с бриллиантовым зеленым (Кол-кер И. И. и соавт., 1977; Жарикова М. С. и соавт., 1983), с пропа-нидом (Алешня Е. П., Алешня В. В., 1977), А-1 и А-2 (Исхако-ва X. И., 1979), с этонием и пенициллином (Тыдельская И. Л. и со­авт., 1980), с солями четвертичного аммониевого основания (Мо­роз А. Ф. и соавт., 1976).

Способ, предложенный Алешня Е. П., Алешня В. В. (1977), не получил распространения, видимо, из-за дефицитности про-панида.

Разработанная на основе смеси этония (выпускаемый в Рос­сии детергент, применяемый в медицине главным образом как противостафилококковый препарат) с пенициллином среда об­ладает неплохими селективными свойствами: на ней ингибиру-ется рост не только стафилококков и стрептококков, но и ба­цилл, кишечных палочек, протея; и лишь в единичных случаях вырастают культуры цитробактера и клебсиеллы. К недостаткам указанной среды относятся многокомпонентность и невозмож­ность длительного (более 2 нед.) хранения готового состава в хо­лодильнике из-за инактивации пенициллина (Рожавин М. А., Бугаева Е. А, 1986).

Zacharian P., Listen J. (1973) установили рост Ps. aeruginosa на «голодном» агаре с (3-аланином, глицином или пролином в качестве источника азота. Добавление фурагина вызывало уг­нетение развития других микроорганизмов, но не влияло на рост Ps. aeruginosa.

Liu P. van (1973) рекомендует среду, содержащую белковую основу, глюкозу, NaCl, фосфат калия двузамещенный и воду.

В НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гама­леи (Москва) разработана сухая среда, состоящая из селектив-

ного агента отечественного производства—N-цетилпиридиния хлорида (N-ЦПХ) в концентрации 0,2% (Мороз А. Ф. и соавт., 1976), а также питательной основы из сухого пептического гид-ролизата казеина и минеральных солей магния, калия. Детер­гент N-ЦПХ в концентрации 0,2—0,5% надежно угнетал рост стафилококков, стрептококков и энтеробактерий. Однако, при этом ингибируются и отдельные клинические штаммы синег-нойной палочки. Позже для улучшения селективных свойств данной среды Мороз А. Ф. и соавт. (1980) вводили в нее фено-зан. Начат промышленный выпуск сухой среды с N-ЦПХ и фе-нозаном. По избирательности и количеству положительных высевов она превосходит зарубежные агары с иргазаном и цет-римидом (Бекбергенов Б. М., 1977; Поликарпов Н. А., 1978; Буль С. М. Колкер И. И., 1978; Раку В. Д. и соавт., 1982; Кол-кер И. И. и соавт., 1982), проста в изготовлении и стабильна при хранении. Между тем, отмечаются недостаточная чувстви­тельность ЦПХ - агара (Каплан А. Е. и соавт., 1982) и возмож­ность роста на ней отдельных штаммов протея и цитробактера (Колкер И. И. и соавт., 1982).

Жарикова М. С. и соавт. (1983) провели оценку эффективно­сти ряда жидких (Кесслера, Хоттингера и бульон с 1% глюкозы) с последующим высевом на МПА с бриллиантовым зеленым и плотных (пропанидовая, Эндо, Плоскирева и МПА с бриллиан­товым зеленым) сред при пересевах с бульона Хоттингера для об­наружения Ps. aeruginosa. Из жидких сред наилучшие результаты получены с использованием бульона Хотингера, а наихудшие— со средой Кесслера. Из плотных сред наилучшие результаты по­лучены на пропанидовой среде, сопоставимые между собой—на среде Эндо и МПА с бриллиантовым зеленым, а худшие—на сре­де Плоскирева. При сравнительном изучении ингибирующей способности сопутствующей микрофлоры у сред Симмонса, МПА с бриллиантовым зеленым, ацетамидной, пропанидовой, Эндо, Плоскирева и висмутсульфитном агара (контролем слу­жил МПА), показано отсутствие на всех них роста St. aureus, спо­ровых аэробных бацилл. Е. coli не дали роста на первых 4 средах, на висмут-сульфитном агаре и среде Плоскирева число колоний было в 2—3 раза меньше, чем в контроле, а результаты посевов на среде Эндо совпадали с контролем. Наибольшим ингибирую-щим свойством относительно протея (роящихся штаммов) обла­дали МПА с бриллиантовым зеленым и среда Симмонса. Слабее ингибировала среда с ацетамидом и не ингибировали среды с пропанидом и Плоскирева. Ростовые качества первых 5 сред бы­ли примерно одинаковыми и сопоставимыми с контролем, тогда как на среде Плоскирева и висмут-сульфитном агаре интенсив­ность роста была в 2 раза меньше.

Отмечают возможность замены МПА с бриллиантовым зеле­ным на одну из следующих сред: Симмонса, ацетамидный или пропанидовый агар.

Считается, что на вторые сутки можно идентифицировать около 75% культур Ps. aeruginosa по морфологии колоний и образованию сине-зеленого пигмента, а остальную часть— на 3-ьи сутки. Однако в связи с чувствительностью к ингибито­рам определенного количества клинических изолятов этого микроорганизма, особенно выделяемых от больных с кистоз-ным фиброзом (до 9%), полагают необходимым, с целью повы­шения эффективности выявления возбудителя, проводить по­севы на селективные и неселективные среды (Fonseca К. et al., 1986).

Отечественным лабораториям МЗ СССР для выделения Ps. aeruginosa рекомендованы в качестве унифицированных ЦПХ-агар и ацетамидный агар (приказ № 535 от 22.05.85, при­ложение 1).

Таким образом, по Мороз А. Ф. и соавт. (1988) наиболее ин­формативными и доступными для лабораторий тестами иденти­фикации Ps. aeruginosa являются рост на среде с N-ЦПХ, поло­жительный цитохромоксидазный тест, способность окислять глюкозу на среде Хью-Лейфсона в аэробных условиях и расти на ацетамидном агаре. Посев на среды Кинга А и В позволяет до­полнительно идентифицировать 5—10% штаммов по образова­нию характерных пигментов.

Evans M. et al. (1986) исследовали чувствительность Ps. aerug­inosa к 7 антибиотикам методом микроразведений в 10 видах жидких сред, главным образом являющихся модификациями бульона Мюллера-Хинтона. Чувствительность к карбеницилли-ну, тикарциллину и пиперациллину слабо варьировала на раз­личных средах. Значительные отличия обнаружены в тестах с мо-ксалактамом и аминогликозидами. Добавление к бульону Мюл­лера-Хинтона сыворотки человеческой крови приводило к появлению 14—50% ложноположительных результатов чувстви­тельности Ps. aeruginosa к моксалактаму. На триптиказо-соевом и питательном бульонах, бульоне для бруцелл обнаружено 10—72% случаев ложной устойчивости к аминогликозидам. Результаты подтвердили необходимость строгого выполнения рекоменда­ций, в соответствии с которыми чувствительность Ps. aeruginosa к антибиотикам следует определять на бульоне Мюллера-Хинто­на, стандартизированном по содержанию двухвалентных катио­нов.

Федорина А. П. (1987) использовала для селекции Ps. aerugi­nosa сахарный бульон с добавлением 0,22—0,66 мг/мл сульфата цинка.

Gill V, Stock F. (1987) предлагают среду PFA для одновремен­ного выявления пиоцианинового и флуоресцеинового пигмен­тов Ps. aeruginosa, превосходящую другие аналогичные и состоя­щую из 15 г/л дегидрированного МН-агара («Difco»), 12 г/л же­латинового пептона («Becton Dickinson»), 8 г/л сульфата калия,

5 мл/л глицерина, 1,5 г/л MgCh*6I-LO и 13 г/л агара; рН среды до­водят до 7,2. Учитывая, что во многих практических микробиоло­гических лабораториях пиоцианин расценивается как 1 из основ­ных видовых признаков Ps. aeruginosa, среда PFA поможет, по мнению авторов, упростить и ускорить процедуру его первичной идентификации.

Keeven J., De Cicco В. (1987) разработали селективную среду для выделения Ps. aeruginosa (высеваемость 100%), в состав кото­рой входят 15 г/л соевого с переваром казеина бульона; 15 г/л агара, 0,1 г/л фенантролина. Рост Ps. fluorescens и Ps. putida на­блюдался в виде мелких колоний и в более поздние сроки, чем Ps. aeruginosa. Рост других псевдомонад, грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей полностью ингибиро-вался. Состав среды более прост и она дешевле, чем ранее разра­ботанные для выделения Ps. aeruginosa среды Pseudosel Agar и Pseudomonas Isolation Agar.

Tomas J., Oliver-Rodes B. (1987) рассматривали вопрос об оп­тимальных концентрациях селективного агента в питательной среде.

Campbell M. et al. (1988) разработали селективную среду для выделения Ps. aeruginosa, состоящую из агара Колумбия, в кото­рый добавлены фенантролин, 9-хлор-9-/ 4- (диэтиламино)- фе-нил/-9, 10- дигидро-10-фенилакридингидрохлорид (С-390) до конечной концентрации 30 мкг/мл каждый. Она превосходила селективные среды с фенантролином, С-390, ацетамидом и цет-римидом.

Гивенталь Н. И. и соавт. (1989) определяли чувствительность Ps. aeruginosa к антибиотикам в жидкой синтетической питатель­ной среде.

Для выявления Ps. aeruginosa Schubert R. (1989) предлагает среду ABGP из пептонного бульона с глюкозой, аргинином и бриллиантовым зеленым, включающую следующие ингредиен­ты (г/л): казеиновый пептон—17; пептон из соевых бобов—3; NaCl—5; сульфат аргинина—10 и глюкоза—0,5. После сте­рилизации и охлаждения в среду добавляют 10 мл крезолово-го красного (0,3%-ый раствор); 7,5 мл бромтимолового си­него (0,2%-ый раствор) и 0,075 мл бриллиантового зеленого (0,5%-ый раствор). Рост Ps. aeruginosa в среде с аргинином в те­чение 48 ч при 37°С сильно зашелачивает ее, в результате чего серовато-зеленая окраска индикатора в среде изменяется до си­не-фиолетовой. Бриллиантовый зеленый в использованной концентрации подавляет рост грамположительных микроорга­низмов, но не токсичен для Ps. aeruginosa. При культивиро­вании проб более 48 ч наблюдаются ложноположительные ре­акции. Для получения чистых культур делается засев из жид­кой среды на плотную после инкубации на ABGP в течение 24-48 ч.

Синяшин Н. И. и соавт. (1990) изучали физиологические осо­бенности (способность пигментообразования, накопления био­массы) Ps. aeruginosa при использовании питательных субстра­тов, приготовленных по разным технологиям. Накопление био­массы наиболее выражено на модифицированных бульонах Мартена. Перевар по Хоттингеру уступал экспериментальным средам. Однако, окончательную оценку роли питательных сред можно дать, считают авторы, изучив антигенные комплексы су-пернатантов и самой биомассы.

Калина Г. П., Комзолова Н. Б. (1988) приводят достаточно полный обзор применения жидких сред накопления при поис­ках Ps. aeruginosa в объектах окружающей среды и патологиче­ском материале. Авторы рекомендуют модифицированную среду Bonde (замена пенициллина кристаллическим фиолето­вым как более мягким ингибитором), признанную официаль­но и проверенную на большом материале. Для выделения Ps. aeruginosa из пищевых продуктов Szita G., Biro G. (1990) разработали селективную дифференциальную синтетическую среду, основанную на свойстве этого микроорганизма утилиз-ровать аммоний из неорганических источников азота. Она включает ацетамид и ацетат в качестве источников азота и уг­лерода, соответственно. Среда высокочувствительна, стан­дартна, позволяет непосредственно изучать важные дифферен­циальные биохимические свойства, дешева, подлежит хране­нию, может быть приготовлена в сухом виде и пригодна для замены контрольных сред.

Сиволодский Е. П. (1990) рекомендует селективную среду «Pseudomonas APS» для одноэтапного выделения и идентифика­ции Ps. aeruginosa и Ps. putida, обладающую «лучшей чувствитель­ностью и избирательностью, чем перечисленные». Ее примене­ние основано на выявленном свойстве отечественного лекарст­венного препарата оксафенамид (п-оксифенилсалициламид) избирательно подавлять рост бактерий.

Журило А. А. (1991) изучал эффективность новых селектив­ных к Ps. aeruginosa и тормозящих рост сопутствующей микро­флоры агентов: легкодоступного и широко используемого в сель­ском хозяйстве рамрода (пропахлора, ацимида)-2 хлоризопро-пилацетамида и комплекса сульфат гидразина, грамурин, этоний, N-ЦПХ, в котором первый компонент является веду­щим. Эти селективные агенты добавляли в среды РЧЖ (Чаплин­ский В. Я., Журило А. А., 1987) и Ж, соответственно, и сравнива­ли с кровяным и N-ЦПХ агарами. Среды РЧЖ и Ж не содержат дефицитных компонентов, дешевы и малотрудоемки. Техноло­гия приготовления среды РЧЖ представлена Горбуновой М. Л. и соавт. (1984). Она состоит из 7 г/л пептона; 7 г/л KSOi; 1,5 г/л MgSOt; 1,5 г/л MgCL; 12 г/л агар-агара, 40 г/л рамрода и 25 мл/л глицерина. MIC рамрода в среде РЧЖ, обеспечивающая ее селе­ктивность, равнялась 0,00035—0,0004 мкг/мл. Селективный ком-

плекс эффективно действовал при соотношении компонентов (г/л): пептон 18—22; сульфат калия 6—8; сульфат магния 1,7— 2,5; MgCL 1,3—1,7; сульфат гидразина 0,08—0,1; грамурин 0,06— 0,07; этоний 0,003-0,005; N-ЦПХ 0,03-0,04; агар-агар 9,5-12; рН 7,2—7,4. Количество колоний псевдомонад на среде РЧЖ бы­ло в 15—20 раз меньше, чем в контроле (МПА), тогда как на сре­де Ж-лишь в 1,5—2 раза. Колонии на среде Ж значительно круп­нее, чем на других селективных средах.

Сравнительные исследования Якубчак О. Н. (1997) эффек­тивности выделения и идентификации Ps. aeruginosa на средах с цитримидом, этонием, антибиотиками, N-ЦПХ и СА-03 пока­зали относительно высокую их чувствительность (за исключе­нием среды с N-ЦПХ) и селективность (среды с цетримидом и СА-03—на них, помимо Ps. aeruginosa, росли только 2 вида по­сторонней микрофлоры). Скорость роста на всех средах была примерно одинаковой (наибольшая на средах СА-03 и с этони­ем). Тем не менее, с целью повышения селективности, автором разработаны среды М и Mi, особенностью которых является от­сутствие ингибиторов посторонней микрофлоры, отрицательно влияющих и на собственно Ps. aeruginosa. Среды основаны на использовании мочевины (аммиака) в качестве источника азо­та (большинство других бактерий не могут расщеплять мочеви­ну); глюкозы—источника углерода; сульфата—источника сер­ных соединений, необходимых для образования белков; аспа-рагина (в среде М он отсутствует) и ионов К⁺—для облегчения образования пигмента.

Комзолова Н. В. (1991), оценивая факторы патогенности Ps. aeruginosa, использовала авторскую среду АгЖел 1986)— при определении наличия желатиназы, 5% кровяной агар—ге­молизина, желточный агар—лецитиназы и обезжиренное мо­локо—казеиназы.

Штаммовую зависимость накопления биомассы Ps. aerugi­nosa от среды выращивания установили Нуриддинова Н. Р. и со­авт. (1991). Пигментообразование было наиболее интенсивным на среде из свиных и кроличьих желудков, а также на среде из свиных гузенков по сравнению со средами Мартена и Хоттинге-ра. Применение среды из кроличьих желудков способствовало появлению таксономического признака-металлического блеска с зонами лизиса и повышению антагонистической активности штаммов.

Дорофеев А. Г. (1994) выращивал Ps. aeruginosa на синтетиче­ской среде с глюкозой в качестве единственного источника угле­рода и энергии (Паников Н. С. и соавт.. 1980).

Культивирование Ps. aeruginosa с целью получения экзоток­сина А проводят на плотных и жидких средах (Перт С, 1978; Ба­скакова Н. В. и соавт., 1983; Баснакьян И. А., 1989; Liu P., 1964; Arvidson S., 1973; Alouf J., 1985; Belohlavek S. et al, 1985). Чаще

всего используется бульон Мартена или триптический соевый бульон.

Аджиева А. А. и соавт. (1987) предложили для его культиви­рования среду, включающую белковую основу, ряд неорганиче­ских солей, а также хелатообразующий агент (дельта-оксидиа-мидоуксусная кислота), связывающий ионы металлов, входя­щих в активный центр металлозависимых протеиназ, блокирующих их действие на экзотоксин А. В связи с изготов­лением среды в двух вариантах, рекомендуется и два способа получения экзотоксина А.

Blumentals I. et al. (1987) разрабатывали среду определенно­го химического состава и двухступенчатый метод культивиро­вания, обеспечивающие увеличение выхода экзотоксина А, вырабатываемого Ps. aeruginosa. При этом шт. РА-103 растили на диализованном триптиказо-соевом бульоне, обогащенном добавлением 1% глицерина и 0,05 М глутамата натрия. Следы железа из бульона удалялись с помощью хелатора Chelex-100. Параллельно использовали синтетическую среду, включавшую набор аминокислот, солей и Сахаров в заданном соотношении. Выращивание вели в 2 этапа. На первом использовали выше­описанный обогащенный триптиказо-соевый бульон и выво­дили культуру на стадию раннего стационара. Затем отмытые клетки пересевали на свежий бульон, полностью освобожден­ный от следов железа и продолжали культивирование еще 5— 6 ч. Накопление биомассы Ps. aeruginosa на бульоне шло при­мерно также, как и на синтетической среде, но после полного удаления Fe²⁺ выход биомассы с бульона возрастал. Увеличение концентрации глицерина с 2,5 до 35 г/л увеличивало выход эк­зотоксина А в среду выращивания с 0,8 до 2,1 мг/л. Добавление Fe²⁺ к бульону тормозило синтез мРНК, транслирующей ин­формацию о синтезе экзотоксина А. Напротив, ионы Са²⁺ уси­ливали его синтез.

Кузнецова Т. Н. и соавт. (1991) оптимизировали процесс глу­бинного культивирования Ps. aeruginosa с целью получения экзо­токсина А использовав определенную дозу экспоненциальной посевной культуры и рациональный режим аэрации.

Известно, что бактериологическая диагностика сапа—опас­ного инфекционного заболевания человека и животных, возбу­дителем которого является Ps. mallei, сложна и не позволяет с уверенностью идентифицировать его среди других псевдомонад. Манзенюк О. Ю. и соавт. (1994) выращивали псевдомонады, в том числе Ps. pseudomallei, Ps. mallei и др., на плотной среде КГК, содержащей 10 мл/г глицерина; 1 г/л КНРО-сЗНгО; 1 г/л КН2РО4; 0,3 г/л MgSO* • 7Н2О; 0,03 г/л FeSO* • 7Н2О; недеионизи-рованный солянокислотный гидролизат казеина с аминным азо­том 30±5 мг%; 15 г/л агара.

С целью обнаружения возбудителя мелиоидоза подозри­тельный материал обычно засевают на МПА или МПБ с 3—5% глицерина. Так как в патологическом материале от больных (гной, мокрота, испражнения и др.) и особенно в объектах внешней среды широко представлена посторонняя микрофло­ра, изолировать возбудителя мелиоидоза прямым посевом не всегда удается. Для подавления других видов микроорганизмов Miller W. et al. (1948) рекомендуют применять различные кра­сители: кристаллический фиолетовый (1:200 000), профлавин, акрифлавин, акридин оранжевый, акридин желтый (1:500 000), фуксин основной или кислый (1:100 000), малахитовый или бриллиантовый зеленые (1:1 000 000). С этой же целью авторы предлагают добавлять в исследуемые пробы 1000 ЕД/мл пени­циллина и после выдержки 3 ч при 37°С сеять на МПА с 3—5% глицерина.

Учитывая малую чувствительность возбудителя мелиоидоза к полимиксину и стрептомицину, Ширяев Д. Т. и соавт. (1976) ре­комендуют добавлять их в питательную среду в соотношении 100 и 50 мкг/мл, соответственно, при исследовании проб из объектов внешней среды. Такие концентрации антибиотиков, подавляя рост большинства видов посторонней микрофлоры, не угнетали рост музейных штаммов возбудителя мелиоидоза.

В качестве обогатительных применяют жидкую среду Леви­на или среду МакКонки. Chambon L. (1955) показал, что при посеве проб воды и почвы, взятых в эндемичных районах, в жидкую среду Левина с пересевом после 48 ч инкубации при 37°С на плотную среду Левина возбудитель удается выделять чаще, чем при прямом посеве этих проб на оптимальную среду. При посеве материала на среду МакКонки (Farkas-Himsley H, 1968) к ней добавляют 20 мкг/мл колимицина. В этих случаях большинство сопутствующих грамотрицательных бактерий не растет. Однако при больших посевных дозах и на этой среде может обильно расти целый ряд микроорганизмов. С целью идентификации бактерий, выросших на среде МакКонки с ко-лимицином, предложено использовать оксидазный тест, а для оксидазоположительных видов—ферментацию сахарозы и маннозы на среде Кинга и выращивание на дезоксихолат-цит-ратном агаре.

Ряпис Л. А., Ширяев Д. Т. (1974) в качестве селективной предложили плотную синтетическую среду, основой которой служит 2% забуференный агар с 0,025% сульфата магния и 0,1% сульфита натрия, к которой добавляется (3-аланин до конечной концентрации 0,03 М. На этой среде при посеве чистых культур многих видов микроорганизмов наблюдался рост лишь возбуди­телей сапа и мелиоидоза, а также синегнойной палочки, но при добавлении 25 мкг/мл неомицина прекращался также рост всех штаммов возбудителя сапа.

3 3-235

3*

Разработаны и другие селективные среды для выделения воз­будителя мелиоидоза (Ashdown D., 1979; Galimandi M., Dodin A., 1983) успешно апробированные в экспериментах и эндемиче­ских регионах Юго-Восточной Азии, Австралии, Ирана, Фран­ции.

Показана возможность использования для этих целей стан­дартных диагностических сред: кровяного агара; агара МакКон-ки; цистин-лактозного агара, дефицитного по содержанию элек­тролитов (Walsh A., Wuthiekanun V., 1996).

Поповцева Л. Д. (1982) дает характеристику питательным средам, применяемым для выделения и идентификации возбу­дителя мелиоидоза, и предлагает оптимальную схему.

Фарбер С. М. и соавт. (1977) при получении сферопластов из возбудителей сапа и мелиоидоза и выделении из них мембран­ных структур использовали МПА с 5% глицерина. На этой же среде Денисов И. И. и соавт. (1995) выращивали Ps. pseudomallei СВБДО-141.

По данным Leelarasamee A., Bovornkitti S. (1989) рост оксида-зоположительных Ps. pseudomallei отмечается только на пита­тельном агаре и на среде с минеральными солями.

Плеханова Н. Г. и соавт. (1992) разработали среду (ФГК— бульон), обеспечивающую наиболее высокий уровень продук­ции экзопротеаз при поверхностном культивировании Ps. pseu­domallei. При этом индекс протеолиза составил 4,0; тогда как на среде Лурия—3,6; а на МПБ—2,0. Среда состояла из фермента­тивного гидролизата казеина (1,5%), экстракта кормовых дрож­жей (0,5%), минеральных солей (хлорида натрия, солей железа и магния), рН 6,9 и оказалась наиболее эффективной из 12 изу­ченных, не содержала импортных ингредиентов. Для глубинно­го культивирования использовали среду, содержащую гидроли-заты казеина, гороха, черного альбумина и минеральные соли (Плеханова Н. Г., 1994).

Степин А. А. и соавт. (1992) отмечают снижение продукции микробных клеток и протеолитической активности экзопротеаз возбудителя мелиоидоза в анаэробных условиях. Активная аэра­ция среды увеличивала выход бактериальной массы на 50%, а протеолитической активности—на 30%.

Коллектив под руководством Самыгина В. М. (1994) усовер­шенствовал питательную среду на основе гидролизатов казеина для культивирования возбудителей сапа и мелиоидоза.

Ps. mallei растет на МПГА в виде полупрозрачных серовато-белых колоний с перламутровым отливом, сливающихся в сплошной налет; на МПГБ и синтетической питательной среде (Евглевский А. А., 1973) образует муть, пристеночное кольцо, пленку и осадок, поднимающийся со дна пробирки штопором при встряхивании. На картофельной среде Павловского дает рост блестящих гладких колоний цвета меда, также сливающих­ся и темнеющих со временем. Посев культуры на обезжиренное

молоко вызывает его свертывание без пептонизации на 10—14 сут. Посев производственного штамма на среду Гисса с набором Сахаров не изменяет окраски среды и не вызывает образования газа, тогда как некоторые другие штаммы расщепляют глюкозу и лактозу (цит. по Буковой Н. К., 1996). Ввиду высокой, в сравне­нии с другими микроорганизмами, чувствительностью к анти­микробным препаратам, до настоящего времени не разработано для Ps. mallei достаточно эффективной селективной среды. Ис­пользуемые, тем не менее, для подавления роста посторонней микрофлоры красители и антибиотики при прямом посеве ис­следуемого материала задерживают и без того недостаточно ак­тивный рост возбудителя сапа.

В последние годы все чаще в патологическом материале больных стали встречаться Ps. cepacia—бактерии с весьма широ­ким спектром питания, включающим бензилпенициллин. Осо­бую угрозу они представляют при кистозном фиброзе, вызывая более тяжелые осложнения и больший процент летальных исхо­дов, чем Ps. aeruginosa (Prince A., 1986).

На основе окислительно-ферментативной среды с добавками лактозы, бацитрацина и полимиксина В разработана агаризован-ная селективно-диагностическая среда OFPBL для выделения Ps. cepacia от больных кистозным фиброзом. Ps. cepacia росли в виде желтых колоний на фоне зеленовато-желтой среды за счет разложения лактозы и даже сильные щелочеобразователи из р. Proteus при росте в ассоциациях с Ps. cepacia не влияли на окра­ску колоний последних. На этой среде процент выделения Ps. cepacia был в 2—3 раза выше, чем на других (Muszynski M. et al., 1986; Welch D.etal, 1987).

Carson L. et al. (1986) сравнивали рост Ps. cepacia, выделенных от больных кистозным фиброзом и из других источников, на се­лективных средах—PCG, OFPBL, ТВ-Т, ацетамидной среде и агаре МакКонки. По сравнению с кровяным агаром (контроль­ная среда) лучшими ростовыми свойствами обладали PCG (93,4% выросших КОЕ) и OFPBL (84,4%), худшими—ацетамид-ный агар (62,7%). На среде МакКонки росли 8,1% шт. Ps. cepacia от больных кистозным фиброзом, 46,8% шт. Ps. cepacia от боль­ных другими патологиями и 84,1% шт. Ps. cepacia из окружающей среды.

Евдокимова Н. В. и соавт. (1994) изучали Ps. fluorescens в про­цессе азотного голодания, выращивая на синтетической среде следующего состава (мг/л): глюкоза—2000—6000; KNO>—3000— 6000; КНРОа-ЮОО; КНРО^-Ю; NaCl-1000; MgS04-7H20-200; СаСЬ-2Н2О-40; KI-0,1; FeCb.6HiO-0,4; MnS04• 4НЮ-0,4; Na₂Mo04 • 2№О-0,2; ZnSO* • 7Н>О-0,4; H.BO,-0,5 и ЭДТА-Na-5,0.

Подольская В. И. и соавт. (1994) использовали при изучении разложения цианидного комплекса серебра культурой Ps. fluo­rescens синтетическую питательную среду следующего состава

(г/л): КН2РО4-2; K2HPO4-I; Na2CO₃.10H2O-0,5; MgSO4-0,3; NaCl—0,1; пептон—0,5; глюкоза—2.

Селективные среды для выделения Ps. putida на сегодняш­ний день фактически не разработаны. Максимова Н. П. и со-авт. (1994) для характеристики флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, продуцируемого бактериями Ps. putida, выра­щивали их в питательном бульоне, среде Кинга В (King Е. et al., 1954), либо минимальной или агаризованной среде М 9 (Мил­лер Дж., 1976), которую перед автоклавированием обрабатыва­ли 8-оксихинолином для выделения ионов железа (Meyer J. et al., 1978).

Седина С. А. (1992) исследовал влияние NaCl и метанола на рост культуры Ps. putida BS-2, утилизирующей диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода. Зависимости удельной скорости роста на среде с диэтиленгликолем от нали­чия в ней NaCl и метанола в диапазоне концентраций 0—4% и 0—20 г/л, соответственно, подчинялись уравнению неконку­рентного торможения. При концентрации NaCl более 4% отме­чено полное разобщение процессов конструктивного и энерге­тического метаболизма.

Кулаев И. С. и соавт. (1987) изучали условия культивирова­ния Ps. lytica, обеспечивающие максимальное накопление в культуральном фильтрате фермента, обладающего бактериоли-тической активностью в отношении ряда грамположительных микробов. Показана возможность синтеза фермента лишь при введении в среду органических источников азота-пептона и триптона. Значительно повышался уровень его синтеза при добавлении в среду убитых клеток St. aureus в дозах от 0,5 до 2,5 мг/мл среды. Мальтоза, сахароза, галактоза, глюкоза и N-ацетилглюкозамин при концентрациях 0,1% в 5—10 раз сни­жали синтез фермента, но стимулировали накопление биомас­сы Ps. lytica. Делается вывод о регуляции биосинтеза фермента по механизму катаболитной репрессии. Отмечено отрицатель­ное влияние на синтез фермента некоторых солей в концентра­циях, используемых обычно для приготовления питательных сред.

Будченко А. А., Викторов Д. В. (1992) анализировали белко­вый спектр Ps. pseudomallei, Ps. cepacia и Ps. aeruginosa при вы­ращивании на различных средах. Анализ пептидограмм куль­тур Ps. pseudomallei показал наибольшее количество фракций в спектре (следовательно более широкий диапазон синтеза пеп­тидов) на минимальной среде Gilardi, меньшее—на F-arape и TSab и минимум—на питательном агаре. Спектры Ps. cepacia и Ps. aeruginosa в гораздо меньшей степени зависели от вида среды.

Жога Л. К. и соавт. (1995) при конструировании транспорт­ной среды для патогенных псевдомонад в качестве консерванта использовали глицерин, ингибиторов—антибиотики и красите-

ли. В состав среды входил также гидролизин, представляющий собой кислотный гидролизат крови КРС. Небольшое количест­во его (0,05%) обеспечивало, однако, питание и сохранение ис­комых псевдомонад. Ингибиторы роста сопутствующей микро­флоры не влияли на возбудителей сапа и мелиоидоза, устойчи­вых к ампициллину (MIC 250—500 мкг/мл), полимиксину (1000 мкг/мл) и генциановому фиолетовому. Состав (г/л): глицерин— 200; гидролизин—0,05; NaCl—5; ампициллин—0,01; полимик-син—0,0025; генциановый фиолетовый—0,0025.

Рожавин М. А., Бугаева Е. И. (1986) представили краткий, но емкий обзор литературы по использованию селективных агентов для выделения Ps. aeruginosa, анализируя их достоинства и недо­статки. Это, помимо описанных выше ацетамида, цетримида N-ЦПХ, N-ЦПХ с фенозаном, этония с пенициллином, пропани-да, бриллиантового зеленого, иргазана, также кристаллический фиолетовый с нейтральным красным (Daly J. et al., 1984), кри­сталлический фиолетовый с телозином и канамицином (Mossel D. et al., 1976), производные 5-нитрофурана-фурациллин, фура-гин, фурадонин (Ароне Р. М., Чурсина Т. В., 1976; Mossel D. et al., 1976; Negretti E, Trabattoni C, 1984), пенициллин с новобиоци-ном с С-390 (Sands D., Rovira A, 1970), С-390 (Marold L. et al., 1981; Araj G., 1984; Robin Т., Janda M., 1984). При использовании индикаторной среды Daly J. et al. (1984) оказалось возможным в первые 24 ч. идентифицировать 97% клинических изолятоввоз-будителя синегнойной инфекции.

Вульфдитер Ш., Петер К. (1992) предлагают для получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы культивировать соответству­ющие микроорганизмы-продуценты из рода Pseudomonas (Ps. putida) на питательной среде, содержащей в качестве ис­точника углерода DL-лейцин, DL-лизин, DL-карнитин, али­фатические углеводороды с длиной цепи С6-С10, а также ис­точники азота и минеральные соли сульфат магния, фосфат натрия двузамещенный, фосфат калия однозамещенный, со­единения железа и хлора. При этом себестоимость конечного продукта снижается.

Марцинкявичене Л. Ю. и соавт. (1991) предлагают с целью повышения активности и чистоты холестеринэстеразы культи­вирование его продуцента Ps. mendocina ВКПМ В-2173 на пита­тельной среде, содержащей (г/л): в качестве источника углерода лактозу 1—5; индуктора-соевую муку 20—40; а также двузаме­щенный фосфат калия 0,5—2,5; семиводный сульфат магния 0,5—0,8; хлорид калия 0,3—0,8; нитрат натрия 1—3; говяжий жир 3—8 и воду.

Завалова Л. Л. и соавт. (1992) сравнивали дестабилазную и пептидазную активности экстрактов Ps. hirudinis, выращенных на различных питательных средах (LB, NB, ВН и синтетиче­ские). Отобраны условия культивирования в больших (до 2 кг биомассы) объемах на В и БВК-средах. Сравнительный анализ

бактериальных экстрактов выявил в обоих случаях одинаковый уровень дестабилазной и значительно более высокий уровень суммарной пептидазной активности для БВК-экстрактов.

Бойков Ю. Н. и соавт. (1991) предлагают для повышения вы­хода фермента и его активности при культивировании Ps. stutzeri ВКПМ В-4724-продуцента рестриктазы Psu 1, использовать пи­тательную среду, содержащую (г/л) в качестве источника амин-ного азота панкреатический почечный гидролизат 15—20; а в ка­честве минеральных солей-сульфат аммония 1—2; цитрат натрия 0,5—0,7 и хлорид железа 0,001-0,002.

Бурдь В. Н. и соавт. (1994) перед клонированием гена бром-пероксидазы из Ps. aureofaciens культивировали клетки в среде, содержащей (г/л): бактотриптон—10; дрожжевой экстракт—5; хлорид натрия—5; добавляя при выращивании на чашках Петри 1% агара.

Pierce L., Schroth M. (1994) разработали простую процедуру определения колоний Pseudomonas, которые аккумулируют poly-betahydroxybutyrate (PHB), продукт накопления, характеризую­щий многие нефлуоресцирующие псевдомонады на среде с нильским голубым. Колонии РНВ-положительных бактерий флуоресцировали от ярко оранжевого до желтого цвета под длин­новолновым ультрафиолетовым с когда вырастали на среде, со­держащей РНВ и краситель нильский голубой. Яркие оранжевые флуоресцирующие гранулы были видны внутри клеток, когда рассматривались микроскопически под ультрафиолетовым осве­щением. Колонии флуоресцирующиех псевдомонад не флуорес­цировали на этой среде, флуоресцирующие гранулы не были ви­димы микроскопически. Эта методика позволяет обнаруживать РНВ-положительные псевдомонады без микроскопического ис­следования. Среда с нильским голубым также была полезна как дифференциальная изолирующая для Pseudomonas solanacearam и может быть для других нефлуоресцирующих псевдомонад.

Упомянутая выше среда Кинга А в дальнейшем была моди­фицирована. Meed G., Adams В. (1977) показали, что уменьше­ние содержания цетримида до 10 мкг/мл позволяет расти всем пигментированным и непигментированным психрофильным псевдомонадам. Для увеличения его селективного действия они добавили 50 мкг/мл цефалоридина и 10 мкг/мл фуцидина. В ре­зультате была разработана селективная для псевдомонад среда CFC (Cephaloridine-Fucidin-Cetrimide).

Stanbridge L., Board R. (1994) использовали модифицирован­ную среду CFC для дифференциации мясных псевдомонад и эн-теробактерий. Некоторые виды семейства Enterobacteriaceae раз­вивающиеся на кусках говядины, упакованных в регулируемой атмосфере, могут расти на среде CFC. Добавление 1% аргинина и 0,002% индикаторы рН фенолового красного в эту српду позво­ляло дифференцировать две группы. Псевдомонады продуциро­вали аммиак из аргинина, в то время как энтеробактерии вообще

не использовали этот субстрат. Смещение рН в щелочную сторо­ну внутри и вокруг колоний псевдомонад вызывало розовое ок­рашивание с феноловым красным.

Azad H., Cooksey D. (1995) разработали среду oleander knot agar (OKA) для изоляции Ps. savastanoi из растений олеандра. Среда ОКА содержала (г/л) агара 14,0; L-серина 2.0; дрожжевого экстракта 1,0; NH4*HiPO4-0,5; lGHPO4*3H2O-0,5; NaCl-5,0; MgS04*7H20—0,2; борной кислоты 1,0; ванкомицина0,15; цефа-лексина—0,05; бацитрацина 0,05; ампициллина 0,015; новобио-цина 0,02 и циклогексимида 100. Все 39 штаммов Ps. savastanoi из различных географических областей росли на среде ОКА и коли­чественный выход составлял от 5,7 до 93,6% (в среднем =43.6%). Среда ОКА была селективнее чем другие исследованные среды, включая BCBRVB, M-71, KBBC, MSP, пролиновый агар и PVF-1, и ингибировала от 89 до 96,7% сапрофитных бактериальных штаммов, выделяемых из тканей олеандра. 44% других исследо­ванных бактерий, патогенных для растений, не росли на среде ОКА, а 13% росли скудно. Среда ОКА использовалась для обна­ружения эпифитных популяций Ps. savastanoi из галлов, листьев, стволов и цветов, а также для обнаружения системного движения бактерии в стволах олеандра. Патоген был представлен в про­мывной воде от 26 из 34 предположительно здоровых растений олеандра. 31 из этих растений впоследствии вырабатывали галлы в течение 1 года. Бактерия была также способна к системному движению на 25 см выше и 20 см ниже места инокуляции.

Jeppesen С. (1995) предложил несколько сред, особенно для обнаружения Aeromonas spp., но также для Plesiomonas shigel-loides и Pseudomonas spp. Некоторые из них были предназначены для общих целей, а другие—специально для исследования образ­цов клинических, окружающей среды и пищевых. Все среды яв­лялись селективными из-за наличия антибиотиков, желчных со­лей, красителей и других, аналогичных по действию, агентов, а также дифференциальными, что было основано прежде всего на способности микроорганизмов ферментировать или не фермен­тировать углеводы. Как со всеми селективными средами, выход стрессированных клеток иногда предотвращался и конкурирую­щая флора не всегда полностью ингибировалась так, чтобы необ­ходимы были подтверждающие тесты на предполагаемые поло­жительные колонии. Выбор специфической среды для изоляции Aeromonas spp. будет всегда зависеть от типа рассматриваемого образца или нужды исследователя в качественном обнаружении или количественном выходе. Самым лучшим для количествен­ной оценки Aeromonas spp. из образцов продовольствия и окру­жающей среды оказался крахмал-ампициллиновый агар (starch ampicillin agar—SAA), хотя можно было бы рекомендовать и дру­гие. Имеется потребность в сравнительном анализе, включая агар Rippey Cabelli (mA), ампициллин-желчные соли-инозитол-ксилозный агар (ampicillin bile salts inositol xylose-MIX agar), ам-

пициллин-декстриновый агар (ampicillin dextrin agar—ADA), декстрин-фуксин-сульфитный агар (dextrin fucSsin sulpSite agar— DFS) и крахмал-глутамат-ампициллин-пенициллин-С-глюкоз-ный агар (starch glutamate ampicillin penicillin C-glucose agar— SGAP-10C) в дополнении к SAA. Для рутинного анализа об­разцов окружающей среды и продовольствия на присутствие P. shigelloides, рекомендуется расширенный посев на инозитол-бриллиантовый зеленый-желчные соли (inositol brilliant green bile salts—IBB) и plesiomonas (PL) агары. Для Pseudomonas spp. агар CFC позволяет количественный выход как пигментированных, так и непигментированых штаммов из образцов продовольствия и окружающей среды, в то же самое время ингибируя большинство других организмов.

Szita G. et al. (1995) разработали синтетическую среду (Z-агар) для селективной изоляции Ps. aeruginosa из пищевых про­дуктов. Синтетическая среда—как источник азота и углерода— содержит ацетамид, при разложении которого на аммиак и ук­сусную килоту Ps. aeruginosa продуцирует для себя необходимые питательные вещества для роста. Среда не содержит ингибито­ров. Селективность ее была проверена инокуляцией чистых культур различных микробов, принадлежащих к группам Pseu­domonas, Enterobacteriaceae, Bacillus и Staphylococcus. Полноцен­ность синтетической среды была также проверена общенацио­нальным тестированием с использованием двух образцов моло­ка, содержащих 10³/мл (образец молока I) и 10⁵/мл (образец молока II) Ps. aeruginosa. Обнаружено, что селективность синте­тической среды была лучше чем цетримидного агара (Cetrimide-agar) предписанного Венгерским стандартом. Общепринятым национальным тестом не выявлено значительных различий меж­ду результатами, полученными на цетримидном и Z-arapax в слу­чае образца молока, содержащего 10⁵/мл Ps. aeruginosa. Однако в молоке, содержащем 10³/мл Ps. aeruginosa, значительные разли­чия обнаруживались в пользу Z-arapa. Результаты были сопоста­вимы и воспризводимы на обоих средах. Новая среда запатенто­вана, производится и продается фирмой «REANAL Fine Chemi­cals» (Венгрия).

Gould W. et. al. (1985) предложили для выделения флуоресци­рующих псевдомонад среды Si и Si, содержащие детергент на-трийлаурилсаркозин и триметоприм.

2.2. Сем. Нейссерии

Известная среда для выделения патогенных нейссерии, со­держащая питательную основу, сыворотку крови, агар-агар и во­ду (Лабинская А. С, 1972), не обеспечивает высоких ростовых свойств (Гаджиева А. Г. и соавт., 1982). Последние авторы для этих целей дополнительно вводят в среду аммониевую соль

5,5 дибром-о-крезолсульфофталеина, а в качестве питательной основы используют казеиново-дрожжевой гидролизат.

West S. et al. (1985) изучали потребление железа патогенными нейссериями (N. gonorrhoeae и N. meningitidis) и по результатам опытов высказали предположение, что экспрессированные у же-лезодефицитных мутантов белки наружной мембраны могут яв­ляться рецепторами трансферрина и лактоферрина.

Усвяцов Б. Я. и соавт. (1987) разработали метод предваритель­ного накопления патогенных нейссерии в среде 199 или Игла для повышения частоты их обнаружения при высеве материала на плотные селективные питательные среды.

Hodge D. et al. (1987) выделили вагинальный штамм нейссе­рии, морфологически и биохимически похожий на менинго­кокк, но серологически на гонококк. Так, при культивировании его на средах без цистеина морфология колоний была типична для N. meningitidis. Это грамотрицательный диплококк, оксида-зо- и каталазоположителен, не расщепляет сахарозу, фруктозу, лактозу и маннит, не обладает p-D-галактозидазной, ДНК-азной и трибутиразной активностью, устойчив к спектиномицину.

Stoakes L. et al. (1987) предложили среду для идентификации в течение 24 ч различных видов p. Neisseria и Branchamella по способности сбраживать сахара. Для приготовления ее основы к 600 мл воды прибавляли 6 г агара Noble, 9 г протеозного пепто­на № 3 («Difco»), 3 г NaCl и 7 мл индикатора Andrade. После пол­ного растворения ингредиентов доводили рН до 8,1 и стерилизо­вали 15 мин при 121°С. К каждым 200 мл основы, охлажденной до 56°С прибавляли по 2 г углевода (декстрозы, мальтозы, саха­розы) и стерилизовали. После этого к каждым 20 мл добавляли по 3 мл суплекса, растворенного в 10 мл дистиллированной воды. Конечное значение рН среды—7,2. Сахаролитическую актив­ность определяли по изменению цвета среды на розовый (в неза­сеянном виде она бесцветна). С ее помощью удалось в течение 24 ч идентифицировать 99,1% нейссерии 9 видов, тогда как на триптиказо-цистиновом агаре—всего 93,7%.

Robinson В., Palma В. (1986) сравнивали методы идентифи­кации Neisseria с помощью коммерческих систем Gonocheck II фирмы «Du Pont» и RIM-N фирмы «Austin Biological» и тради­ционные культуральные методы с использованием агара с цис-тином и Kellogg-arapa. Ошибки при идентификации N. gonor­rhoeae в основном были обусловлены ложноположительными результатами при определении ферментации глюкозы. Эффек­тивность использованных культуральных методов была соот­ветственно равна 67 и 100%, а методов с использованием ком­мерческих систем—99%. Ошибки при идентификации N. meningitidis имели место лишь при использовании Kellogg-ara­pa, эффективность культуральных методов при этом составля­ла, соответственно, 100 и 93,5%. Эффективность методов с ис­пользованием коммерческих систем равнялась 100%. На осно-

воротка, а также длительность культивирования. Выращивание осуществляли на плотных и жидких средах. В качестве плотных использовали тиамин-цистин-глутаминовый агар—ТЦГА (Гад-жиева А. Г., 1975), содержавший 20% сыворотки крови, 1,5% агар на гидролизате мяса по Хоттингеру; среду «25-й вариант» (Мохов Ю. В., 1983); безбелковую среду с казаминовыми кислотами сле­дующего состава: агар «Difco»—25 г/л, глюкоза—7 г/л, NaCl— 10 г/л, казаминовые кислоты—17,5 г/л, глутаминовая кислота— 170 мг/л, крахмальная паста—0,2 л/л, 20%-ый раствор NaOH— 2,75 мл/л. Жидкими средами являлись модифицированная Коэ-на-Уиллера (Фаньковская Э. К. и соавт., 1969) и синтетическая, состоявшая из набора солей и аминокислот. Показана зависи­мость интенсивности микрокапсулообразования от концентрации в среде глюкозы. При содержании ее 7 г/л и более формирование микрокапсулы угнеталось. При этом, вероятно, образование мик­рокапсулы зависело от глубины расщепления в питательной среде крупных белковых молекул. Формирование микрокапсулы не за­висело от содержания в среде аминного азота в изученных кон­центрациях (от 49 до 160 мг%). Наиболее интенсивно микрокапсу­лы образовывались в синтетической среде и на ТЦГА с 20% сыво­ротки, прогретой в течение 1 ч при 56°С, причем формирование поверхностных структур зависело от типа среды. На средах, содер­жавших сывороточные белки, на поверхности микробов, помимо истинной микрокапсулы, формировалась псевдокапсула. Пло­щадь среза ее увеличивалась с повышением концентрации (0— 20%) сыворотки крови в среде, тогда как на формирование микро­капсулы этот показатель не влиял. Добавление в безбелковую сре­ду Коэна-Уиллера ионов Fe³⁺ от 0 до 32 мг/л не сказывалось на интенсивности формирования микрокапсулы и росте биомассы.

Вальвачевым Н. И. и соавт. (1984) подготовлены методиче­ские рекомендации, где представлено 9 рецептур сред для выде­ления и идентификации менингококков, рекомендуемых в соот­ветствии с приказом МЗ СССР № 98 от 29.01.81 «О расширении функций Всесоюзного центра менингококковой инфекции».

Морозова Т. В. и соавт. (1998) предлагают для выделения и культивирования менингококов менингоагар, содержащий в ка­честве белковой основы панкреатичекий гидролизат казеина, ав-толизат дрожжевой, ферментативный гидролизат черного амбу-лина (стимулятор роста гемофильных микроорганизмов), а так­же глюкозу, хлорид натрия и агар-агар.

Jessouroun E. et al. (1995) сравнили экспрессию железорегули-руемого белка наружной мембраны N. meningitidis на триптиче-ском соевом бульоне и синтетических средах: Frantz и неполной Catlin. Хотя экспрессия железорегулируемого белка на первых двух средах не различалась, при получении этих белков для вак­цины предпочтительна среда Frantz, имеющая известный состав.

Дата добавления: 2015-07-08