Определение сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса

Ход работы

Сиаловые кислоты представляют собой N-ацетил- и N-глицилпроизводные нейраминовой кислоты. Эти соединения рассматриваются как нормальные компоненты всех тканей и биологических жидкостей организма человека и животных и являются важной составной частью углевод-белковых (гликопротеинов) и углевод-липидных (гликолипидов) комплексов, в которых занимают обычно краевое положение.

После отщепления от гликопротеидов свободные сиаловые кислоты инактивируют многие бактериальные и вирусные болезнетворные агенты. Поэтому увеличение содержания в крови сиалогликопротеинов может быть проявлением компенсаторной, защитной воспалительной реакции. В свободном виде производные нейраминовой кислоты присутствуют в крови, ликворе, слизистой оболочке желудка, щитовидной железе и др.

Для определения концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови обычно используется колориметрический метод Гесса. При этом безбелковый фильтрат сыворотки крови подвергают гидролизу, в результате чего из состава сиалогликопротеидов выделяются сиаловые кислоты, которые взаимодействуя с уксусной и серной кислотами в условиях повышенной температуры, создаваемой в кипящей водяной бане, дают окрашенные соединения, изменяющие цвет раствора в буровато-розовый или красно-фиолетовый. При этом интенсивность окрашивания зависит от концентрации сиаловых кислот.

В центрифужную пробирку наливают 1 мл сыворотки крови и, осторожно встряхивая, добавляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку помещают на 5 минут в кипящую водяную баню, затем охлаждают обычно путем выдерживания ее в течение 5 минут в ледяной бане или холодной воде, центрифугируют 5 минут при 1000-2000 об/мин.

К 0,4 мл отобранной надосадочной жидкости добавляют 5 мл уксусно-сернокислой смеси и пробы повторно нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут. При этом бесцветный раствор постепенно приобретает красно-фиолетовый цвет. После охлаждения в ледяной бане или под струей холодной воды пробы колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете с шириной слоя 10 мм. В качестве контроля используют 5% раствор серной кислоты в ледяной уксусной кислоте.

Результат выражают либо в условных единицах (при отсутствии стандартного раствора), для чего полученную величину экстинкции умножают на 1000, либо в значениях концентрации ацетилнейраминовой кислоты. В последнем случае расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Из основного стандартного раствора N-ацетилнейраминовой кислоты готовят рабочие растворы, как показано в таблице 7:

Приготовление рабочих растворов Таблица 7.

№ пробирки	Рабочие стандартные растворы, мл	Концентрация нейраминовой кислоты в пробе
Основной стандартный раствор N-ацетилней-раминовой кислоты	Дистиллированная вода	мг%	ммоль/л
	0,10	0,30	25,0	0,80
	0,15	0,25	37,5	1,21
	0,20	0,20	50,0	1,61
	0,25	0,15	62,5	2,02
	0,30	0,10	75,0	2,42
	0,40	-	100,0	3.23

К растворам прибавляют 5 мл уксусно-сернокислого реактива и обрабатывают их так же, как опытные пробы.

В норме содержание сиаловых кислот составляет 135-200 усл.ед., или 62-73 мг% (0,62-0,73 г/л), или 2,00-2,36 ммоль/л N-ацетилнейраминовой кислоты. При инфекционных, аллергических состояниях и некробиотических процессах нарушается тканевой метаболизм с деполимеризацией гликопротеиновых комплексов. В результате этих изменений в сыворотке крови в большом количестве появляются продукты расщепления белково-углеводных комплексов и в связи с этим резко нарастает доля сиаловых кислот.

Гиперсиалемия (повышение уровня сиаловых кислот в сыворотке крови) наблюдается при опухолях головного мозга, инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, раке, эндокардите, лейкемии, лимфогранулематозе, нефротическом синдроме, остеомиелите и других заболеваниях (преимущественно воспалительного характера, а также сопровождающихся распадом соединительной ткани). У больных с активным туберкулезом содержание нейраминовых кислот нередко составляет 5,74 ммоль/л, с подострым бактериальным эндокардитом – 3,3 ммоль/л, с далеко зашедшей раковой опухолью – 4,58 ммоль/л. Их концентрация возрастает также при заболеваниях, связанных с поражением паренхимы печени и коллагенозах.

Гипосиалемия или снижение доли сиаловых кислот в крови отмечается при пернициозной анемии, гемохроматозе, болезни Вильсона-Коновалова и дегенеративных процессах в центральной нервной системе, что, видимо, связано с нарушением биосинтеза гликопротеиновых комплексов.

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ 6.1. Дайте определение гликопротеидам и назовите соединения, входящие в состав их небелковой части.

6.2. Как и по какому принципу можно классифицировать все углевод-белковые комплексы?

6.3. Какие типы связей обнаруживаются между белковым и углеводным компонентами в гликопротеидах?

6.4. Какова биологическая роль гликопротеидов в организме?

6.5. Какие качественно новые свойства белковой молекуле придает углеводная группировка?

6.6. Что такое гликозаминогликаны? В какой ткани обнаруживается наибольшее количество этих соединений?

6.7. Какие продукты образуются при гидролизе небелковой части гликопротеидов? Какими качественными реакциями можно их обнаружить?

6.8. Что такое серомукоиды плазмы крови? Какие соединения относятся к этой группе веществ?

6.9. В чем заключается принцип турбидиметрического метода определения серомукоидов в сыворотке крови? Значение количественного определения серомукоидов в сыворотке крови?

6.10. Что такое сиаловые кислоты и какова их роль в организме?

6.11. Каковы принцип и химизм количественного определения сиаловых кислот в сыворотке крови методом Гесса? Значение количественного определения уровня сиаловых кислот в сыворотке крови.

6.12. Какая реакция является качественной на углеводы?6.13. Какие ткани в живых организмах содержат большое количество гликопротеидов?

Тема: ФОСФОПРОТЕИДЫ

1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить состав и строение фосфопротеидов. 2. ЗАДАЧИ

Дата добавления: 2015-07-08