Открытие действия тирозиназы картофеля

Тирозиназа (катехолоксидаза, полифенолоксидаза) относится к группе ферментов, действующих на фенолы (тирозин, катехоламины и полифенолы) и родственные им соединения. Акцептором электронов в реакции, катализируемой этим энзимом, служит молекулярный кислород.

Тирозиназа является металлопротеином, содержащим медь (0,20-0,25%). Ионы двухвалентной меди являются необходимым компонентом активного центра фермента, действующим как переносчик электронов в процессе окисления и восстановления. После ее удаления фермент инактивируется, в некоторых случаях происходит реактивация энзима ионами Cu²⁺. Тирозиназа распространена в растениях и грибах, особенно много ее содержится в клубнях картофеля. В организме животных и человека тирозиназа локализуется в основном в меланоцитах и катализирует превращение адреналина в физиологически неактивный адренохром. Последний, конденсируясь, превращается в бурый пигмент меланин.

Бронзовый цвет кожи при недостаточности коры надпочечников (болезнь Аддисона) обусловлен избыточной секрецией кортикотропина гипофизом, что приводит к стимуляции меланоцитов, чрезмерной активации тирозиназы в них и, как следствие, избыточному образованию меланина.

Ход работы

Измельченный картофель (0,5-1 г) растирают в фарфоровой ступке с 3 мл дистиллированной воды и фильтруют через два слоя марли. Фильтрат содержит фермент тирозиназу.

Если к раствору тирозина добавить вытяжку из картофеля, содержащую фермент, и смесь для контакта с кислородом воздуха встряхнуть, то жидкость через некоторое время приобретает сначала розовый, потом бурый и черный цвет. Реакция вызвана окислением тирозина кислородом воздуха и протекает благодаря каталитическому действию катехолоксидазы. При этом последовательно образуются галохром (5,6-дигидроксииндол-2-карбоновая кислота) красного цвета и меланин.

В две пробирки наливают по 1 мл вытяжки из картофеля. Содержимое одной пробирки кипятят 1-2 минуты и охлаждают в стакане с холодной водой. В обе пробирки добавляют по 5-10 капель 0,1% раствора тирозина, тщательно перемешивают и помещают в водяную баню при температуре 40-45°С. Через 5 минут их вынимают и сильно встряхивают. Жидкость в пробирке с активной вытяжкой принимает сначала розовую, а затем бурую окраску. В контрольной пробе цвет жидкости не меняется.

Вместо тирозина можно использовать 0,1% раствор адреналина.

4.2. Изучение действия пероксидазы крови

Пероксидазы в большом количестве встречаются в растительных клетках. У животных их активность обнаруживается в эритроцитах, мышцах, молоке. Этот фермент катализирует реакцию окисления многих фенолов и аминов (в частности, гидрохинона, пирокатехина, гваякола, крезола, бензидина, фенилендиамина и некоторых других соединений), причем акцептором водорода в этом случае является перекись водорода. Пероксидаза может окислять также адреналин, в результате чего образуется адренохром. Таким образом, пероксидазой окисляются те же субстраты, что и полифенолоксидазой, но с участием Н₂О₂ или органических пероксидов.

Пероксидазы представляют собой протеиды, содержащие в качестве активной группы железопорфириновый комплекс (родственный гему гемоглобина). Вследствие этого они угнетаются цианидами, сероводородом, гидроксиламином, тиомочевиной, перекисью водорода (при проведении работы необходимо следить за тем, чтобы количество этих соединений в пробах не превышало допустимый уровень). Активность пероксидазы может угнетаться присутствием каталазы из-за усиления реакции разложения перекиси водорода.

Для изучения действия растительных пероксидаз используют водные экстракты хрена и картофеля. Об активности пероксидазы, полученной из растительных продуктов, можно судить по изменению окраски гваяковой смолы или бензидина в присутствии перекиси водорода, которые окисляясь, приобретают синюю окраску.

Ход работы

4.2.1. Гваяковая проба. К полученной взвеси хрена, картофеля или их водному экстракту добавляют 1-2 капли свежеприготовленного спиртового раствора гваяковой смолы. Затем приливают 1-2 капли 0,5% раствора перекиси водорода и наблюдают появление ярко-синего окрашивания. Если указанную пробу выполнять с прокипяченным препаратом фермента, окрашивание не появится, поскольку фермент инактивировался при кипячении.

4.2.2. Бензидиновая проба. К раствору, содержащему пероксидазу хрена или картофеля, добавляют 2-5 капель спиртового раствора бензидина и 1-2 капли 0,5% раствора перекиси водорода, в результате чего развивается темно-синее окрашивание, поскольку бензидин окисляется перекисью водорода в парахинондиимид, соль которого образует окрашенное соединение с неокисленным бензидином.

4.2.3. Пероксидаза крови. Для ее исследования кровь разводят водой в 10 раз и проводят гваяковую и бензидиновую пробы. Параллельно ставят опыт без крови или с ее прокипяченным раствором, в которых фермент либо отсутствует, либо инактивирован.

4.3. Открытие действия каталазы крови

Каталаза – фермент, присутствующий в клетках животных и растительных организмов (особенно много обнаруживается в печени и эритроцитах животных, где ее концентрация доходит до 0,1% сухого вещества клетки). Не обнаруживается она лишь у облигатных анаэробов.

По химической природе каталаза представляет собой олигомерный гемопротеин, так как в состав ее простетической группы входит вещество, близкое по строению к гему. Кроме того, в молекуле данного энзима наряду с геминовыми группами обнаруживается и желчно-пигментная.

Роль каталазы в обмене веществ очень велика. Ей принадлежит защитная функция – освобождение организма от непрерывно образующихся в нем перекиси водорода, фенолов, формальдегидов и т.д., что связывает ее с антиоксидантной защитной системой организма (разрушая токсичную Н₂О₂, фермент предотвращает развитие свободно-радикальных неконтролируемых процессов перекисного окисления липидов). Она предохраняет аскорбиновую кислоту и гемоглобин от сочетанного окисления, снабжает кислородом ряд тканей.

Каталаза ускоряет реакцию разложения перекиси водорода, которая в качестве донора и акцептора водорода использует Н₂О₂, по уравнению:

2 Н₂О₂ ® 2 Н₂О + О₂.

Активность каталазы угнетается цианидами, сероводородом, гидрок-силамином, она неустойчива в сильнокислой среде.

Ход работы

4.3.1. К 2 мл дефибринированной крови приливают 1-2 мл 3% раствора перекиси водорода. При этом происходит обильное выделение кислорода. При повторении опыта с прокипяченной кровью каталазного действия не наблюдается.

4.3.2. К 2 мл молока добавляют 1 мл 3% раствора перекиси водорода и обнаруживают выделение пузырьков кислорода. В опыте с прокипяченным молоком оно отсутствует.

4.3.3. В две пробирки, содержащие по 2 мл свежего и прокипяченного картофельного сока, приливают небольшое количество 3% раствора перекиси водорода. При этом кислород начинает выделяться только в опыте с некипяченым соком.

4.4. Определение активности каталазы крови по Баху и Зубковой

Активность каталазы выражается количеством миллиграммов перекиси водорода, разрушенной за 30 минут при 18°С. Количество Н₂О₂ определяют путем титрования раствором перманганата калия в кислой среде.

Ход работы

В небольшой стаканчик наливают 20 мл дистиллированной воды и добавляют 0,02 мл крови из микропипетки, ополаскивая ее при этом несколько раз. Таким образом, получают кровь, разведенную в 1000 раз.

В 4 конические колбочки емкостью 50 мл наливают по 7 мл дистиллированной воды.

В 2 первые колбы (опытные пробы) приливают по 1 мл разведенной в 1000 раз крови.

В две другие (контрольные пробы) – по 1 мл той же крови, но предварительно прокипяченной.

Затем во все колбы добавляют по 2 мл 1% раствора химически чистой перекиси водорода и на 30 минут ставят их в термостат с температурой 18°С. По истечении указанного времени в колбочки наливают по 3 мл 10% раствора серной кислоты с целью прекращения действия каталазы и подкисления раствора и титруют 0,1N раствором перманганата калия до появления светло-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 секунд.

В первых двух колбах титруется остаток неразрушенной перекиси водорода, в двух последних – все ее количество, взятое для опыта. Долю разрушенной Н₂О₂ можно найти по разности между двумя титрованиями (в расчете учитываются средние значения титрования двух первых и двух последних проб).

Например, если на титрование контрольной пробы пошло 8 мл 0,1N раствора KMnO₄, а на опытную – 3 мл, то количество перекиси водорода, разрушенной каталазой, соответствует 5 мл 0,1N раствора перманганата калия. Полученную разность умножают на 1,7 (так как 1 мл 0,1N раствора KMnO₄ эквивалентен 1,7 мг Н₂О₂) и получают каталазное число исследуемой крови: 1,7 × 5 = 8,5 ед. В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 ед.

Гипокаталаземия (снижение активности каталазы крови) отмечается при ряде инфекционных заболеваний: брюшном тифе, скарлатине, малярии, туберкулезе легких, хронических отравлениях соединениями свинца, мышьяка, ртути, фосфором. Гиперкаталаземия (повышение активности каталазы в крови) наблюдается у детей при бронхолегочных заболеваниях, при этом нарастание активности фермента находится в прямой зависимости от степени легочной недостаточности.

Определение каталазной активности крови представляет интерес в хирургической практике. При этом в ответ на оперативные вмешательства, проводимые под местной анестезией, отмечается подъем ее активности, тогда как операция под общим наркозом приводит к снижению активности энзима. Осложнения нагноительного характера сопровождаются снижением активности каталазы, однако для более точной интерпретации полученных результатов необходим подсчет числа эритроцитов.

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

1. Как классифицируются ферменты по типу катализируемой реакции?

2. К какому классу ферментов относятся a-амилаза и липаза?

3. При каких патологических состояниях в сыворотке крови одновременно повышается активность амилазы и липазы?

4. Какие методы количественного определения активности ­a-амилазы в сыворотке крови и моче используют в клинической практике? На чем они основаны?

5. В каких органах происходит выработка a-амилазы? Какие типы изоамилаз обнаруживаются в сыворотке и моче?

6. Каково значение количественного определения активности a-амилазы в крови и моче?

7. Что является субстратом для липазы поджелудочной железы? Каковы условия ее функционирования? Как можно обнаружить присутствие липазы в вытяжке поджелудочной железы?

8. К какому классу ферментов относятся каталаза, пероксидаза, тирозиназа? Укажите подкласс перечисленных ферментов.

9. Какие из изученных Вами ферментов являются гемопротеидами? Какова их биологическая роль?

10. Какие соединения угнетают активность геминовых ферментов?

11. Что является донором и акцептором водорода в реакциях, катализируемых тирозиназой и пероксидазой?

12. Какую реакцию катализирует катехолоксидаза? Какова ее биологическая роль в организме человека?

13. На чем основано количественное определение каталазного числа крови?

14. К какому классу ферментов относится сукцинатдегидрогеназа? Что является ее субстратом? На чем основан принцип определения активности сукцинатдегидрогеназы в тканях?

15. Какие соединения являются ингибиторами сукцинатдегидрогеназы?

16. Какую реакцию катализирует аланинаминотрансфераза? В каких органах и тканях отмечается наибольшая активность данного фермента?

17. Что такое коэффициент де Ритиса? Чему он равен в норме? Как изменяется его величина при а) инфаркте миокарда, б) остром вирусном гепатите, 3) алкогольном гепатите?

Тема: ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ 1. ЦЕЛЬ Изучить качественные реакции водорастворимых витаминов. 2. ЗАДАЧИ 2.1. Провести качественные реакции на водорастворимые витамины;· Витамин В₁ (тиамин)· Витамин В₂ (рибофлавин)· Витамин РР (никотиновая кислота и ее амид)· Витамин В₆ (пиридоксин)· Витамин С (аскорбиновая кислота)· Количественное определение витамина С2.2. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Витамины – это группа низкомолекулярных органических веществ различного химического строения, которые, присутствуя в пище в небольших количествах, являются незаменимыми ее компонентами и обеспечивают нормальное протекание биохимических и физиологических процессов путем регуляции метаболизма. При этом витамины не включаются в структуру тканей человека и не используются в качестве источника энергии. При отсутствии витаминов в пище развиваются заболевания, которые носят общее название – авитаминозы, а при их недостаточном содержании – гиповитаминозы. Если содержание витаминов в пище велико, то это тоже приводит к заболеваниям – гиперавитаминозам.

Многие витамины представляют собой исходный материал для биосинтеза коферментов и простетических групп ферментов. Поэтому высокая активность ферментов и их влияние на скорость обмена веществ зависит от обеспеченности организма витаминами. Ряд витаминов обладает регуляторными функциями, в частности участвует в регуляции проницаемости мембран и генной экспрессии. Некоторые витамины (Е, А и С), являясь антиоксидантами и предотвращая образование активных форм кислорода и перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов, также участвуют в регуляции клеточного метаболизма.

По растворимости витамины делят на две группы – водорастворимые и жирорастворимые.

Все водорастворимые витамины, за исключением витамина Р и С, содержат в своем составе азот, поэтому их объединяют в комплекс витаминов группы В. они обычно сопровождают друг друга в продуктах и обладают общим свойством – устойчивостью к нагреванию. В отличие от них витамин С к нагреванию не устойчив. При нагревании он быстро разрушается, особенно в присутствии кислорода и солей тяжелых металлов. К водорастворимым витаминам относятся В₁ – тиамин, В₂ – рибофлавин, РР (В₅) – никотиновая кислота и ее амид, В₆ – пиридоксин, В₃ – пантотеновая кислота, Н – биотин, В_с – фолиевая кислота, В₁₂- цианкобаламин, В₁₅ – пангамовая кислота, С – аскорбиновая кислота, Р – рутин. Водорастворимые витамины практически накапливаются в организме, поэтому его чувствительность к их недостатку особенно велика.Витамин В₁ (тиамин) состоит из пиримидинового и тиазолового колец. В организме он входит в состав коферментов ТПФ (тиаминпирофосфата) и ТТФ (тиаминтрифосфата).ТПФ является коферментов ферментов декарбоксилирования (декарбоксилаз) α-кетокислот, поэтому при его недостатке процессы днкарбоксилирования будут нарушены. Это прежде всего относится к декарбоксилированию пировиноградной кислоты (ПВК) – важнейшего промежуточного продукта обмена углеводов Витамин В₂ (рибофлавин) относится к группе естественных пигментов, известных под названием флавинов. Он представляет собой метилированное производное изоаллоксазина, к которому присоединен спирт рибитол. Его биологическое действие во многом определяет наличие активных двойных связей в циклической структуре рибофлавина. По месту двойных связей легко присоединяется водород, при этом рибофлавин, вещество желтого цвета, восстанавливается в бесцветное лейкосоединение Рибофлавин входит в состав коферментов аэробных (вторичных) дигидрогеназ – в состав флавинадениндинуклеотида (ФАД). Поэтому при недостатке рибофлавина происходит нарушение процесса биологического окисления органических веществ, в частности окисления β-оксикислот (восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД х Н₂). Витамин РР (никотиновая кислота и ее амид) является производным пиридина. Никотинамид входит в состав коферментов анаэробных (первичных) дегидрогеназ: НАД (никотинамидаденин-динуклеотида) и НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфата). Поэтому при недостатке витамина РР происходит нарушение процессов биологического окисления органических веществ – как тканевого дыхания, так и брожения. Витамин В₆ (пиридоксин). Пиридоксин – это общее название группы веществ, обладающих активностью витамина В₆: пиридоксола, пиридоксаля, и пиридоксамина. Все они являются производными пиридина: В организме витамин В₆ играет большую роль в обмене белков и аминокислот. Он входит в состав коферментов ферментов троансаминирования (переаминирования) и поэтому участвует в процессах трансаминирования аминокислот (перенос аминогруппы аминокислоты на кетокислоту). Он также входит в состав декарбоксилаз некоторых аминокислот. Поэтому при недостатке витамина В₆ нарушается белковый обмен. Витамин С (аскорбиновая кислота) – вещество, которое по своей химической природе близко к углеводам. Оно очень не устойчиво: В живых организмах витамин С присутствует как в свободном, так и в связанном виде. Связанная с белком аскорбиновая кислота – аскорбиноген – обладает большей устойчивостью к окислителям, чем свободная кислота. Важнейшей особенностью аскорбиновой кислоты является ее способность к обратимому окислению (дегидрированию) с образованием дегидроаскорбиновой кислоты. В живых организмах витамин С принимает участие в окислительно-восстановительных процессах, в синтезе стероидных гормонов, в превращениях аминокислот (тирозина и фенилаланина) и др. Это говорит о том, что биологическая роль аскорбиновой кислоты многообразна. Для обнаружения витаминов применяют качественные реакции. Они основаны на цветных реакциях, характерных для группировок, входящих в состав витаминов. 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 4.1. Качественная реакция на витамин В₁ (тиамин)

Основная роль водорастворимых витаминов сводится к тому, что они являются исходными субстратами для синтеза коферментов, являющихся обязательными компонентами ферментативных реакций.

Дата добавления: 2015-07-08