Определение прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов ткани печени по качественной пробе Л. Делямуре

Прочность связи между белками и липидами в липопротеидных комплексах исследуют методом экстракции липидов серным эфиром с последующей окраской их суданом III.

Ход работы

4.1.1. Экстрагирование липопротеидов из ткани. 1 г печени растирают в ступке, прибавляют 5 мл физиологического раствора, снова тщательно растирают и оставляют стоять 30 мин, периодически перемешивая пробу.

Жидкость с осадка сливают в колбочку, а остаток ткани снова растирают с 5 мл физиологического раствора. Жидкость сливают в ту же колбу, раствор фильтруют или центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают в мерный цилиндр и физиологическим раствором доводят объем до 50 мл.

4.1.2. Экстрагирование липидов серным эфиром из липопротеидного комплекса.

В контрольную пробирку отмеривают 0,9 мл надосадочной жидкости из цилиндра (или сыворотки крови) и 0,1 мл физиологического раствора.

В опытную пробу - 0,9 мл надосадочной жидкости из цилиндра (или сыворотки крови) и 0,1 мл 0,05% раствора тиолового яда (йодацетата).

В обе пробирки приливают по 2-3 капли спиртового раствора судана-III. Пробирки встряхивают, затем добавляют по 1 мл серного эфира, снова встряхивают и оставляют стоять до расслоения жидкостей. В контрольной пробе липопротеидный комплекс не разрушается, поэтому судан-III окрашивает нижний водный слой. В опытной пробе тиоловый яд разрушает связь между белковым и липидным компонентами липопротеида, серный эфир экстрагирует липидный компонент, поэтому судан-III окрашивает верхний эфирный слой.

Результаты работы заносят в таблицу 9:

Результаты опыта Таблица 9.

Проба	Количество надосадочной жидкости, мл	Тиоловый яд, мл	Физиологический раствор, мл	Серный эфир, мл	Результат
	0,9	-	0,1	1,0
	0,9	0,1	-	1,0

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

6.1. Что такое липопротеиды и из каких компонентов они состоят?

6.2. Как можно подразделить липид-белковые комплексы? Какова их биологическая роль?

6.3. Какими белками представлен белковый компонент в сывороточных липопротеидах?

6.4. Каков состав простетических групп липопротеидов?

6.5. Как связаны белковый компонент и простетическая группа в липопротеидах?

6.6. В чем сходство и различия a- и b-липопротеидов, хиломикронов и пре-b-липопротеидов?

6.7. Какие классы сывороточных липопротеинов рассматриваются как атерогенные и антиатерогенные факторы?

6.8. В чем заключается метод определения прочности связи между белковым и липидным компонентами липопротеидов по качественной пробе Л.Делямуре?

6.9. На чем основан метод электрофоретического разделения сывороточных липопротеидов?

6.10. Каково клиническое значение определения a- и b-липопротеидов в сыворотке крови?

6.11. При каких патологических состояниях увеличивается доля b-липопротеидов?

6.12. Что такое гиперлипопротеинемия? Какие типы гиперлипопротеидемий Вам известны?

Тема: ФЕРМЕНТЫ 1. ЦЕЛЬ Изучить свойства ферментов как биологических катализаторов. 2. ЗАДАЧИ 2.1. Изучить определение активности α-амилазы слюны и ее термолабильности.2.2. Влияние реакции среды на активность ферментов и определение оптимума рН действия α-амилазы слюны.2.3. Изучить влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.2.4. Изучить специфичность α-амилазы слюны.2.5. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Ферменты (энзимы) – это биологически активные вещества белковой природы, выполняющие в организме роль катализаторов и поддерживающие на определенном уровне скорость всех протекающих процессов.

По химической природе ферменты делятся на простые (протеины), имеющие в своем составе только полипептидные цепи и при гидролизе образующие аминокислоты, и сложные (протеиды или холоферменты), состоящие из белковой и небелковой частей, называемых апоферментом и кофактором соответственно. Кофакторы, в свою очередь, можно подразделить на легкодиссоциирующие, свободно присоединяющиеся к различным апоферментам (коферменты), и труднодиссоциирующую простетическую группу, взаимодействующую лишь с одним апоферментом. Так, например коферментом лактатдегидрогеназы является никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺), тогда как сукцинатдегидрогеназа имеет в своем составе прочносвязанную с апоферментом простетическую группу, представленную производным рибофлавина – флавинадениндинуклеотидом (ФАД). Кофактор определяет каталитическую специфичность фермента, выступает в роли косубстрата в ферментативной реакции и стабилизирует пространственную структуру апофермента, что играет важную роль в соединении фермента (E) с субстратом (S). В качестве кофакторов могут выступать ионы металлов (Mg²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Zn²⁺ и др.) или вещества органической природы (нуклеотиды, производные витаминов и др.). Апофермент, в свою очередь, определяет субстратную специфичность фермента, непосредственно участвует в связывании фермента с субстратом и облегчает действие кофермента на субстрат. Таким образом, белковая и небелковая части двухкомпонентных ферментных систем могут действовать только согласованно, и дефицит одного из двух названных выше компонентов фермента приводит к нарушению его эффективной работы.

Механизм действия ферментов объясняется теорией гомогенного катализа. Фермент вступает во взаимодействие с субстратом с образованием фермент-субстратного комплекса, который, в свою очередь, взаимодействует дальше. При этом фермент отделяется и затем вступает во взаимодействие с новым субстратом. Таким образом, фермент катализирует реакцию между двумя субстратами, а сам при этом не расходуется. Если же в состав фермента входит кофермент, то фермент катализирует реакцию не между двумя субстратами, а между субстратом и коферментом. Кофермент является связующим звеном между двумя ферментами. Особенностью многих ферментов является обратимость их действия, т.е. один и тот же фермент может катализировать как прямую, так и обратную реакцию.

В молекулах ферментов выделяют активный и аллостерический (регуляторный) центры.

В активный центр фермента входят остатки аминокислот (принадлежащие апоферменту), ионы металлов и коферменты. Эта часть ферментативной молекулы формируется при связывании субстрата и/или кофермента (для холоферментов), а для регуляторных ферментов образование активной конформации аминокислот активного центра возможно при взаимодействии молекулы вещества-активатора, отличного по структуре от субстрата, с аллостерическим центром фермента. В активном центре условно различают два участка: контактный, связывающий субстрат, и каталитический, осуществляющий его преобразование. Первый присоединяет специфический субстрат, образуя промежуточный фермент-субстратный комплекс (ES), второй вызывает его катализ с получением продуктов реакции (Р) и свободного фермента (Е):

E + S «[ES] ® [EP]² ® E + P

В аллостерическом центре, который представляет собой любой участок фермента, не входящий в состав активного центра, присоединяются вещества, называемые эффекторами или модификаторами, в результате чего изменяется пространственная структура молекулы, в целом, и конфигурация активного центра, в частности. Это снижает или увеличивает ферментативную активность, поэтому модификаторы можно подразделить на ингибиторы и активаторы, соответственно.

Ферменты как биологические катализаторы обладают рядом общих свойств, важнейшими из которых являются высокая активность и специфичность действия. Все ферменты проводят катализ в очень мягких условиях и обладают очень высокой активностью. Ферменты обладают специфичностью, так как каждый из них катализирует лишь определенные химические реакции. Различают абсолютную и относительную специфичность действия. Ферменты, обладающие относительной специфичностью действия, катализирует реакции у близких по строению веществ, действуя на определенный тип связи. К ним относят ферменты желудочно-кишечного тракта: трипсин, пепсин и др. Ферменты, обладающие абсолютной специфичностью, действуют на один определенный субстрат. Так, мальтаза расщепляет мальтозу, не оказывая никакого действия на сахарозу. Поскольку ферменты являются белками, на их активность влияют температура (они термолабильны), рН среды, наличие различных химических веществ и т.д. Следовательно, скорость ферментативного катализа зависит от многих факторов: температура, рН среды концентрации субстрата и фермента и т.д. Одним из важнейших факторов, от которого зависит активность фермента, является температура. С изменением температуры активность фермента изменяется. Каждый фермент имеет свой температурный оптимум. У большинства ферментов он лежит в интервале 37-40^оС. Повышение температуры выше 70^оС приводит к потере активности фермента. Фермент необратимо инактивируется вследствие денатурации белка. Понижение температуры, как и повышение, приводит сначала к уменьшению, а потом и к полной активности фермента. Но при низких температурах ферменты не разрушаются, поэтому при последующем повышении температуры их активность восстанавливается (обратимая инактивация). Активность ферментов меняется в зависимости от реакции среды. Для каждого фермента существуют оптимальные значения рН, при котором он проявляет максимальную активность. Так, для пепсина оптимальные значения рН=1.5-2.5, в то время как трипсин при таких условиях полностью теряет способность гидролизовать белки. Оптимум его действия наступает при рН=8-9. На скорость ферментативного катализа влияет также присутствие определенных веществ, которые могут и увеличивать активность фермента (активаторы), и уменьшать ее (ингибиторы). Активаторы и ингибиторы влияют на активный центр фермента, способствуя его образованию (активаторы) или блокированию (ингибиторы). Одно и тоже вещество для одного фермента может быть активатором, а для другого – ингибитором.

Изучение влияния различных факторов на скорость ферментативного катализа проводят, используя ферменты слюны: амилазу и мальтазу. Действие ферментов выявляют либо по исчезновению субстрата, либо по появлению продуктов его расщепления. Амилаза катализирует гидролиз гликозидной связи крахмала и гликогена, расщепляя сначала их до декстринов, а затем до мальтозы. Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины в зависимости от размера дают разное окрашивание – от фиолетового до красно-бурого. Мальтоза с йодом окрашивания не дает. Мальтаза расщепляет мальтозу до глюкозы, имеющей альдегидную группировку, по реакции на которую она может быть обнаружена.

Большинство ферментов, катализирующих химические реакции, протекающие в живом организме, функционируют внутри тех клеток, в которых синтезируются (за исключением ферментов органов пищеварения и отдельных энзимов плазмы крови). Тем не менее на основании результатов ферментативного анализа внеклеточных жидкостей (особенно плазмы или сыворотки крови) можно сделать заключение об изменениях, происходящих внутри клеток разных органов и тканей.

В основе многих болезней лежат нарушения нормального функционирования ферментативных процессов. Изменения в специфических ферментативных реакциях можно рассматривать как причину или следствие различных патологических состояний. Эта взаимосвязь наиболее отчетливо выявляется при некоторых врожденных нарушениях метаболизма, называемых энзимопатиями. Например, фенилкетонурия возникает вследствие дефекта фермента фенилаланин-4-монооксигеназы, галактоземия является результатом мутаций одного из трех генов, кодирующих ферменты метаболизма галактозы, дефицит лизосомальных ферментов приводит к развитию патологических состояний, известных под названием «болезней накопления» (тезауризмозов) – сфинголипидозов, мукополисахаридозов и др.

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 4.1. Определение активности α-амилазы слюны и ее термолабильности

Фермент a-амилаза (диастаза) содержится в слюне и ускоряет гидролитическое расщепление a-1,4-гликозидных связей в молекулах полисахаридов (крахмала, гликогена) до декстринов и мальтозы. Процесс распада полисахаридов в присутствии a-амилазы включает в себя ряд стадий: крахмал ® амилодекстрины ® эритродекстрины ® ахродекстрины ® альтотетроза ® мальтоза. При этом нерасщепленный крахмал при взаимодействии с раствором йода дает синее окрашивание, амилодекстрины – фиолетовое, эритродекстрины – красно-бурое, ахродекстрины, альтотетроза и мальтоза – желтое. Кроме того, конечный продукт гидролиза крахмала – мальтоза – имеет свободную альдегидную группу, которую можно обнаружить реакцией Троммера (Фелинга).

В основе пробы Троммера лежит окислительно-восстановительная реакция восстановления гидрата окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (красного цвета) при нагревании. Таким образом, по окраске раствора, содержащего слюну и крахмал, с йодом или проведением реакции Троммера можно выявить степень активности a-амилазы.

Одним из характерных свойств ферментов, является термолабильность, т.е. чувствительность к температуре, при которой протекает реакция. Для многих энзимов максимальная скорость реакции наблюдается при 38-40°С. При нагревании выше 50°С они утрачивают свойства биологических катализаторов вследствие денатурации, при этом степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа мала. При повышении температуры от 0°С до 40°С скорость реакции увеличивается, а затем тепловая денатурация фермента снижает ее.

Ход работы

Слюну разводят в мерном цилиндре в 10 раз. В чистую пробирку отливают небольшое количество (2-3 мл) разведенной слюны и кипятят ее в течение 5-8 минут, а затем охлаждают.

В 4 пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала.

В первые две пробирки добавляют по 10 капель разведенной слюны.

В третью – 10 капель прокипяченной слюны.

В четвертую – 10 капель воды (в качестве контроля). Первую пробирку помещают в ледяную баню, а остальные – в термостат или водяную баню при температуре 38°С на 10 минут.

После этого содержимое пробирок делят на 2 части и проводят качественные реакции на крахмал и продукты его расщепления (йодную пробу и пробу Троммера).

Йодная проба. К 2 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора Люголя (раствора йода в KI). Первая проба приобретает фиолетовое окрашивание, третья и четвертая окрашиваются в синий цвет вследствие отсутствия или инактивации a-амилазы, вторая проба приобретает буро-желтую окраску в связи с расщеплением крахмала активной a-амилазой до декстринов.

Реакция Троммера. К 5 каплям исследуемой жидкости добавляют 5 капель 10% раствора едкого натра и 5 капель 1% раствора сернокислой меди. Содержимое пробирки нагревают над пламенем горелки. Появление красного цвета указывает на присутствие в растворе мальтозы и глюкозы (положительная реакция Троммера).

Результаты исследования записывают в таблицу 10:

Результаты опыта Таблица 10.

Материал исследования	Субстрат	Контрольные реакции	Чем обусловлена реакция
Йодная проба	Проба Троммера
Свежая слюна (0°С)	Крахмал
Свежая слюна (37°С)	Крахмал
Прокипяченная слюна	Крахмал
Контроль (Н2О)	Крахмал

4.2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции

Ход работы

Берут 4 пробирки, наливают в них по 10 капель 0.5%-ного раствора крахмала (субстрата). Первую пробирку ставят в снег (лед), вторую оставляют при комнатной температуре (15-20^оС), третью ставят в термостат при температуре 45^оС, четвертую - на водяной бане при температуре 75^оС. В 4 другие пробирки наливают по 10 капель дистиллированной воды и по 1 капле 0.1%-ного раствора йода. Через 5 минут в пробирки с крахмалом добавляют по 10 капель слюны, разведенной в 10 раз (1 капля слюны и 9 капель воды), хорошо перемешивают и оставляют при той же температуре (0, 15-20, 45 и 75^оС). Через 5 минут после того, как в пробирки добавили слюну, из каждой из них берут по 1-2 капле жидкости и вносят в заготовленные пробирки с йодом. Если во всех пробирках жидкость окрашивается в синий цвет, реакцию повторяют через 5 минут со вновь приготовленными пробирками с йодом, а затем повторяют еще через 5 минут. Различная окраска при реакции с йодом, а, следовательно, разная степень гидролиза крахмала обусловлена разной скоростью ферментативного катализа при разных температурных условиях. В работе важно уловить нужный момент для йодной пробы, так как при длительном гидролизе полное расщепление крахмала может произойти и при низких температурах опыта. Результаты опыта записывают в таблицу 11 и делают выводы. Влияние температуры на действие фермента Таблица 11.

Температура, ^оС	Окраска крахмала с йодом через определенное время, мин
5	10	15	20
0^оС
15-20^оС
45^оС
75^оС

4.3. Влияние реакции среды на активность ферментов и определение оптимума рН действия α-амилазы слюны

Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимумом рН. Для разных ферментов существует свой оптимум рН, совпадающий с их изоэлектрической точкой. Большинство ферментов активны при значениях рН, лежащих в области 6-8, однако некоторые энзимы имеют оптимальную активность в сильнокислой или сильнощелочной области. Так, для пепсина желудочного сока оптимум рН равен 1,5-2,5; для аргиназы печени – 9,5. Оптимум рН действия a-амилазы слюны лежит в зоне 6,8-7,1. В кислой и щелочной средах активность амилазы снижается. Оптимум рН для нее можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН.

Ход работы

В 6 пробирок наливают растворы 0,2М двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1М лимонной кислоты в количествах, указанных в таблице 12:

Приготовление буферных растворов Таблица 12.

№ пробы	Количество 0,2М Na2HPO4, мл	Количество 0,1М лимонной кислоты, мл	рН смеси	Количество буферной смеси, мл	Количество разведенной слюны	Количество раствора крахмала, мл	Окрашивание с раство-ром Люголя
	2,5	2.5	5,0	0,1	1,0	2,5
	3,0	2,0	5,8	0,1	1,0	2,5
	3,5	1,5	6,3	0,1	1,0	2,5
	4,0	1,0	6,9	0,1	1,0	2,5
	4,5	0,5	7,5	0,1	1,0	2,5
	5,0	-	8,2	0,1	1,0	2,5

При этом получают буферные растворы с рН от 5,0 до 8,2.

В 6 других пронумерованных пробирок наливают по 2,5 мл 0,1% раствора крахмала и по 0,1 мл буферной смеси с различным значением рН. Затем в каждую добавляют по 1 мл разведенной в 10 раз слюны, перемешивают и на 5 минут помещают в термостат или водяную баню при температуре 38-40°С. По истечении указанного времени пробирки вынимают и в каждую приливают по 1 капле раствора Люголя.

Оптимум рН действия амилазы слюны определяют по той пробирке, в которой произошло наиболее полное расщепление крахмала (при реакции с раствором йода в этом случае наблюдается красная или желтая окраска). Результаты исследования записывают в таблицу 12 и делают выводы.

4.4. Влияние активаторов и парализаторов на активность α-амилазы слюны

Активаторами и парализаторами (ингибиторами) называют вещества, способные ускорять или тормозить действие ферментов. Активаторы и ингибиторы часто используют при биохимических исследованиях для изучения отдельных ферментов в тканях. Добавлением различных ядов удается блокировать активные центры одних ферментов, не изменяя при этом действия других (специфическое ингибирование). В качестве примера можно привести действие производных диизопропилфторфосфата (ДФФ) на ферменты, содержащие в активном центре аминокислоту серин (холинэстераза) или монойодацетата на тиоловые ферменты. Специфическое ингибирование ферментов следует отличать от неспецифического, наблюдаемого при действии различных денатурирующих агентов на большинство белков-ферментов. К таким агентам относят температуру, минеральные и органические кислоты, соли тяжелых металлов в высоких концентрациях (соли ртути, свинца, меди и др.).

В некоторых случаях действие фермента не проявляется при отсутствии активирующих агентов. Например, a-амилаза после диализа полностью теряет способность расщеплять крахмал, и вновь приобретает ее после добавления хлористого натрия. Таким образом, активность фермента значительно возрастает в присутствии ионов хлора, которые являются его активаторами. Кроме того, в структуру молекулы a-амилазы входит ион кальция, который не только ее активирует, но и предохраняет от потери активности и гидролиза при действии протеолитических ферментов. Поэтому активность фермента ингибируется фторидами, цитратом, оксалатом и этилендиаминтетраацетатом натрия (ЭДТА), связывающими ионы кальция.

Если к смеси, содержащей крахмал и амилазу, в одном случае прилить хлористый натрий, в другом – воду (в качестве контроля), а в третьем – раствор сернокислой меди, то через некоторое время при действии раствора Люголя жидкость в пробе с NaCI окрасится в желтый цвет, в контрольной – в красный, а в пробе с CuSO₄ - в синий. Различный цвет жидкостей обусловлен неодинаковой степенью гидролиза крахмала и свидетельствует об активирующем влиянии на фермент a-амилазу слюны хлористого натрия и парализующем – медного купороса.

Ход работы

Берут 3 пробирки, наливают по 3 мл разведенной в 10 раз слюны и в первую по 3 капли 1% раствора хлорида натрияво вторую по 3 капли 1% раствора сульфата медив третью по 3 капли воды. Затем в каждую пробирку добавляют по 5 капель 1% раствора крахмала, оставляют на 5 минут при комнатной температуре, после чего приливают по 1 капле раствора Люголя. Различная окраска при реакции с йодом, а, следовательно, разная степень гидролиза крахмала обусловлена разной скоростью ферментативного катализа пи добавлении различных веществ. Результаты опыта записывают в таблицу 13 и делают выводы.

Результаты опыта Таблица 13.

Фермент	Субстрат	Окраска жидкости после добавлении йода в присутствии:
NaCI	CuSO4	H2O
a-амилаза	крахмал

4.5. Специфичность α-амилазы слюны

Одно из наиболее характерных свойств ферментов – их высокая специфичность. Энзимы способны катализировать только определенные химические реакции (каталитическая специфичность), а также обладают избирательностью действия по отношению к субстратам (субстратная специфичность). В зависимости от механизма действия выделяют ферменты с абсолютной и относительной специфичностью. Абсолютная специфичность действия заключается в способности фермента катализировать превращение только одного субстрата (аргиназа, уреаза). Для ферментов с относительной специфичностью существенное значение имеет тип преобразуемой химической связи в молекуле субстрата (пищеварительные ферменты – пепсин, трипсин, липаза, a-амилаза и др.).

Фермент a-амилаза слюны ускоряет гидролиз полисахаридов, имеющих в своем составе a-1,4-гликозидную связь (крахмал, гликоген), но не действует на дисахариды, в том числе мальтозу, образующуюся при гидролизе крахмала. В слюне содержится также фермент мальтаза, которая ускоряет гидролиз только дисахарида мальтозы, но не оказывает никакого действия на дисахарид сахарозу. Следовательно, в слюне имеются ферменты, расщепляющие крахмал до мальтозы и глюкозы, и отсутствуют ферменты, расщепляющие сахарозу.

Сахароза (также как и крахмал) не является редуцирующим сахаром и не дает реакции Троммера. Однако, продукты гидролиза сахарозы и крахмала обладают восстанавливающей способностью (реакция Троммера в этом случае будет положительной).

Ход работы

В две пробирки наливают по 5 капель слюны.

В первую добавляют 10 капель 1% раствора крахмала,

во вторую – 10 капель 10% раствора сахарозы.

После чего помещают обе пробирки в термостат при температуре 37°С на 10 минут. По истечении указанного времени пробирки вынимают из термостата и с их содержимым проводят реакцию Троммера.

При этом в пробирке с гидролизатом крахмала жидкость окрашивается в желтый цвет, в пробирке, содержащей сахарозу, окраска раствора не меняется.

Результаты работы заносят в таблицу 14 и делают выводы.

Результаты опыта Таблица 14.

Фермент	Субстрат	Основной тип гликозид-ной связи субстрата	Проба Троммера
+	-
Амилаза и мальтаза слюны	крахмал	a-1,4-
Амилаза и мальтаза слюны	сахароза	b-1,2-

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ 6.1. Что такое ферменты и какую роль они выполняют в организме?

6.2.Какова химическая природа фермента? В чем отличие ферментов-протеинов от ферментов-протеидов?

6.3.Какие составные части выделяют в молекулах холоферментов? Какова их роль в катализе?

6.4.В чем заключается отличие ферментов от неорганических катализаторов?

6.5.От каких факторов зависит активность ферментов?

6.6.Как обнаружить присутствие фермента в реакционной смеси? Как обнаружить присутствие a-амилазы в слюне?

6.7.Что понимают под термолабильностью ферментов? С помощью каких приемов можно определить температуру, при которой наблюдается максимальная активность a-амилазы?

6.8.Почему при температуре больше 50°С большинство ферментов теряют свою активность?

6.9.Что понимают под оптимумом рН действия ферментов? Как можно определить оптимум рН действия a-амилазы слюны?

6.10. Что такое активаторы и ингибиторы ферментов? Назовите активаторы и ингибиторы a-амилазы.

6.11. Какие виды специфичности ферментов Вы знаете?

6.12. Какие ферменты содержатся в слюне? Гидролиз каких углеводов (крахмала или сахарозы) происходит при добавлении к ним слюны? С помощью какой реакции можно выявить наличие или отсутствие гидролитического расщепления крахмала или сахарозы?

Тема: БИОХИМИЯ СЛЮНЫ 1. ЦЕЛЬ Изучить рН и состав слюны. 2. ЗАДАЧИ 2.1. Определить рН слюны.2.2. Определить фосфаты в слюне.2.3. Обнаружить роданиды в слюне.2.4. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Выделение слюны в слизистую полости рта осуществляется 3-мя парами желез. Клетки околоушной железы продуцируют секрет серозного типа, а клетки подчелюстной и подъязычной желез – секрет смешанного типа. При низкой скорости секреции слюна сильно гипотонична; ее осмотическое давление увеличивается с повышением скорости слюноотделения, и при его максимальной скорости слюна может становиться почти изотоничной плазме. Слюноотделение возникает рефлекторно – либо под воздействием безусловных рефлексов, вызванных факторами механического характера, например присутствие во рту инородного тела, или условно рефлекторно, например при виде и запахе пищи. Слюна смачивает пищевую массу и делает ее более скользкой, что облегчает проглатывание пищи. Слюна человека содержит амилазу, катализирующую гидролиз полисахаридов до смеси олигосахаридов. Муцины подчелюстных желез содержат около 60% углеводов (сиаловую кислоту, N-ацетилгалактозамин, фукозу, галактозу). Олигосахаридные группировки муцинов образуют О-гликозидные связи с остатками серина или треонина полипептидной цепи. Полностью гликозилированные полипептидные цепи муцина в водных растворах ассоциируют за счет нековалентных взаимодействий, образуя высокомолекулярные агрегаты. Агрегаты муцина образуют структуры, отличающиеся значительной протяженностью, прочно удерживающие воду внутри молекулярного матрикса, благодаря этому раствору муцина обладают значительной вязкостью. Удаление сиаловой кислоты значительно снижает вязкость раствора муцина. Неэнзиматические макромолекулярные гликопротеины слюны имеют особое значение для вязкости ротовой жидкости и тем самым для скольжения съеденных кусочков пищи. К тому же углеводные части несут анионные группы, которые обусловливают сильную гидратацию. Вязкость слюны в 10-20 раз выше, чем у плазмы. 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 4.1. Определение рН слюны

Ход работы

Каплю слюны наносят на универсальную индикаторную бумагу и немедленно сравнивают полученную окраску со шкалой рН от 6.0 до 8.0.В норме слюна имеет рН близкий к нейтральному (6.4-7.0). Сдвиг в кислую сторону нарушает процессы минерализации и способствует развитию кариеса, а также создаются условия для воздействия кислых протеиназ на ткани парадонта.4.2. Определить фосфаты в слюне

Ход работы

2 мл слюны осаждают 2 мл 10% раствора ТХУ. Фильтруют. К 2 мл фильтрата добавляют 4 мл 5% раствора молибденовокислого аммония в 5 н. H₂SO₄ с добавлением 0.5% раствора аскорбиновой кислоты. Перемешивают и инкубируют в термостате при 45оС в течение 20 минут. Наблюдают появление синего преходящего окрашивания, и выпадение осадка желтого цвета комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония.4.3. Обнаружение роданидов в слюне Роданиды слюны обнаруживают по появлению красного окрашивания при добавлении к слюне хлорного железа. Это типичная и чувствительная реакция на роданиды обусловлена образованием роданистой соли трехвалентного железа в результате взаимодействия ионов Fe³⁺ и SCN^- и образования различных комплексов, имеющими состав от Fe(H₂O)₅NCS²⁺ до Fe(NCS)₆^3-. Некоторые органические соединения, например соли лимонной и уксусной кислот, препятствуют образованию окраски.

Ход работы

К 5 каплям слюны добавляют 2 капли 2% раствора HCl и 2 капли 0.01% раствора FeCl₃. На местах повреждения слизистой оболочки полости рта происходит эмиграция гранулоцитов, которые принимают участие в защитных реакциях. В гранулоцитах локализован фермент лактопероксидаза, которая окисляет имеющийся в слюне роданид с помощью перекиси водорода бактериального происхождения в гипотиоционат.SCN^- + Н₂О₂ → ОSCN^- + Н₂О Гипотиоционат чрезвычайно бактерициден и совместно с Н₂О₂ или ее радикалами действует антикариесогенно. Содержание роданидов велико в слюне курильщиков, что связано с поступлением в их организм синильной кислоты табачного дыма. 5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, включает условия протекания реакций, экспериментальные данные и выводы.6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ 6.1. Как определить рН слюны?6.2. Как определить содержание фосфатов и роданидов слюне?6.3. Чем связано увеличение роданидов в слюне у курильщиков?

Тема: КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

1. ЦЕЛЬ Изучить активность ферментов. 2. ЗАДАЧИ

2.1. Исследовать активность оксидоредуктаз

2.2. Изучить действие пероксидазы крови

2.3. Открыть действие каталазы крови

2.4. Определить активности каталазы крови по Баху и Зубковой

2.3. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

В соответствии с природой катализируемых энзимами реакций выделяют 6 основных классов ферментов:

1. Оксидоредуктазы – энзимы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции;

2. Трансферазы - обеспечивающие реакции межмолекулярного переноса химических групп;

3. Гидролазы - вызывающие гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей в субстрате;

4. Лиазы - катализирующие реакции негидролитического расщепления или присоединения химических групп по месту локализации двойных связей;

5. Изомеразы - обеспечивающие ферментативные процессы изомеризации;

6. Лигазы (синтетазы) - ускоряющие реакции синтеза, т.е. соединения двух субстратов, протекающих за счет энергии гидролиза макроэргических связей АТФ.

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

4.1. Исследование активности действия тирозиназы картофеля

К классу оксидоредуктаз относятся ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. По химической природе они являются сложными белками. В их состав входят производные витаминов РР (НАД⁺, НАДФ⁺), В₂ (ФМН, ФАД), соединения геминовой природы; аскорбиновая кислота, ионы металлов (Cu²⁺, Fe²⁺) и др.

Оксидоредуктазы делятся на подклассы в зависимости от того, какие химические группировки являются донорами или акцепторами электронов: 1) анаэробные дегидрогеназы осуществляют перенос атомов водорода от окисляемого субстрата на любое органическое соединение, но не на О₂ (в качестве небелковой части они содержат, главным образом, производные витамина РР); 2) аэробные дегидрогеназы катализируют реакции переноса атомов водорода непосредственно на кислород с образованием перекиси водорода (по химической природе эти ферменты являются флавопротеинами); 3) оксидазы осуществляют транспорт водорода от субстрата на кислород с образованием в качестве конечного продукта воды (в их составе обнаруживаются ионы металлов, обычно ионы Cu²⁺); 4) цитохромы – гемсодержащие белки, участвующие в транспорте только электронов в цепях митохондриального и микросомального окисления; 5) оксигеназы катализируют реакции включения кислорода в молекулу окисляемого субстрата (в составе их молекул обнаруживаются НАДФН+Н⁺ и тетрагидробиоптерин); 6) гидроксипероксидазы, участвующие в разложении перекиси водорода.

Дата добавления: 2015-07-08