Коферментная функция водорастворимых витаминов

Таблица 15.

Название витамина	Название коферментов	Основные реакции, в которых принимает участие кофермент
Тиамин	Тиаминпирофосфат (ТПФ)	Окислительное декарбоксилирование a-кетокислот; транскетолаза
Рибофлавин	ФМН и ФАД	Окислительно-восстановительные реакции
Ниацин	НАД^+ и НАДФ^+	Окислительно-восстановительные реакции
Пиридоксин	Пиридоксальфосфат	Реакции трансаминирования, дезаминирования, декарбоксилирования аминокислот
Кобаламин	Метил- и дезоксиаденозилкобаламин	Реакции метилирования и изомеризации метилмалонил-КоА
Фолиевая кислота	Тетрагидрофолат	Перенос одноуглеродных радикалов, биосинтез ДНК
Пантотеновая кислота	HSKoA	Реакции ацетилирования и ацилирования
Аскорбиновая кислота		Реакции гидроксилирования в синтезе коллагена, гормонов коры и мозгового слоя надпочечников, метаболизме тирозина

Для обнаружения витаминов в пищевых продуктах или биологических объектах обычно используются качественные реакции, основанные на образовании характерного окрашенного соединения витамина с каким-либо химическим реактивом. Эти реакции также лежат в основе количественного определения витаминов в продуктах питания и жидкостях организма (сыворотка крови, моча), что имеет важное значение для определения обеспеченности ими организма человека.

Тиамин (солянокислый) – бесцветное кристаллическое вещество. Он содержится в хлебе из муки грубого помола, крупах, горохе, фасоли, пивных и пекарских дрожжах и мясных продуктах. Суточная потребность в этом витамине составляет 1,5-2 мг. Его коферментная форма – тиаминпирофосфат (кокарбоксилаза) – входит в состав ферментов, катализирующих реакции простого и окислительного декарбоксилирования a-кетокислот (пировиноградной и 2–оксоглутаровой) и транскетолазы. Благодаря этому витамин В₁ способствует окислению пирувата и 2-оксоглутарата в митохондриях и следовательно, образованию энергии из углеводов и аминокислот.

Как известно, транскетолаза обеспечивает деятельность неокислительной фазы пентозофосфатного пути окисления углеводов, который является главным источником НАДФН+Н⁺ и единственным источником рибозо-5-фосфата в клетках. Поэтому тиамин необходим для осуществления всех биохимических процессов, использующих НАДФН+Н⁺ (синтез жирных кислот, стероидов, дезинтоксикации лекарств и ядов и т.д.) и рибозо-5-фосфат (синтез нуклеотидов, нуклеиновых кислот, нуклеотидных коферментов).

Тиаминовая недостаточность, называемая болезнью бери-бери, проявляется нарушениями метаболизма и функций пищеварительной, сердечно-сосудистой и нервной систем. При данном заболевании увеличивается содержание пировиноградной кислоты в крови, моче, мозговой, нервной и других тканях, уменьшается ее использование в энергетическом обеспечении тканей, особенно зависящих от углеводов, что обуславливает возникновение нарушений функционирования нервной ткани и полиневриты. При заболевании бери-бери отмечается выраженный отрицательный азотистый баланс, быстрое общее истощение и атрофия органов.

4.1.1. Реакция окисления тиамина в тиохром основана на окислении тиамина в щелочной среде железосинеродистым калием. В результате реакции образуется желтый пигмент тиохром, обладающий голубой флуоресценцией.

Ход работы

К 1 капле 5% раствора тиамина (или к 1-2 мг порошка) добавляют 5-10 капель 10% раствора едкого натра, 1-2 капли 5% раствора железосинеродистого калия и перемешивают.

При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет вследствие превращения тиамина в тиохром. При освещении раствора тиохрома ультрафиолетовыми лучами можно наблюдать голубую флуоресценцию.

4.1.2. Диазореакция на тиамин. Тиамин с диазореактивом образует в щелочной среде сложное комплексное соединение оранжевого цвета.

Ход работы

Диазореактив готовят, сливая в пробирку по 5 капель 1% раствора сульфаниловой кислоты и 5% раствора азотистокислого натрия.

Затем добавляют небольшое количество порошка тиамина (на кончике стеклянной палочки) и 5-7 капель 10% раствора бикарбоната натрия (по стенке наклоненной пробирки). На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета.

4.2. Качественная реакция на витамин В₂ (рибофлавин)

Источником рибофлавина для человека служат продукты питания и частично кишечные бактерии. Им богаты печень, почки, желток куриного яйца, творог. В растительных продуктах содержится меньше рибофлавина. Суточная потребность в нем взрослого человека составляет 1-3 мг.

Рибофлавин входит в состав простетических групп флавиновых ферментов в виде флавинаденинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида (ФАД). Флавопротеиды составляют большое семейство окислительно-восстановительных ферментов, окисляющих различные метаболиты и переносящих водород на различные акцепторы. Флавиновые ферменты участвуют в синтезе гемоглобина и многочисленных реакциях окисления веществ в клетках: переносе электронов и протонов по дыхательной цепи, окислении пирувата, сукцината, 2-оксоглутарата, a-глицеролфосфата, жирных кислот, биогенных аминов, альдегидов.

Недостаток в витамине В₂ проявляется в снижении содержания его коферментных форм (прежде всего ФМН) в тканях, а также в симптомах поражения эпителия слизистых кожи и роговицы глаза. Наблюдаются сухость и покраснение слизистых губ и полости рта, трещины в углах рта и на губах, повышенное шелушение кожи (особенно лица) из-за медленного обновления клеток эпителия, сухость конъюктивы, ее воспаление, светобоязнь, прорастание роговицы сосудами (васкуляризация) и ее помутнение.

Окисленная форма рибофлафина представляет собой желтое вещество, флуоресцирующее в ультрафиолетовых лучах. В основе качественной реакции на витамин В₂ заложена его способность восстанавливаться сначала в родофлавин (промежуточное соединение) розового цвета, а затем в бесцветное соединение лейкофлавин,

Ход работы

В пробирку наливают 10 капель раствора рибофлавина, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и небольшой кусочек металлического цинка. В результате взаимодействия цинка с соляной кислотой происходит интенсивное выделение водорода. Жидкость в пробирке постепенно розовеет, а затем обесцвечивается. Происходящая реакция обусловлена восстановлением рибофлавина выделяющимся водородом сначала в красный родофлавин, а затем в бесцветный лейкофлавин.4.3. Качественная реакция на витамин РР (никотиновая кислота и ее амид) Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди образует синий осадок медной соли никотиновой кислоты, плохо растворимый в воде. В пробирку вносят 10 капель 1%-ного раствора витамина РР и нагревают до кипения, при этом если раствор был мутным, то он станет прозрачным. К нагретому раствору витамина добавляют 10 капель 2%-ного раствора ацетата меди и снова нагревают до кипения, после чего пробирку сразу же охлаждают под струей холодной воды. На дне пробирки выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.4.4. Качественная реакция на витамин В₆ (пиридоксин) Витамин В₆при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета. В пробирку вносят 10 капель 1%-ного раствора витамина В₆, добавляют 10 капель 1%-ного раствора хлорного железа и хорошо перемешивают. Раствор в пробирке окрашивается в красный цвет.4.5. Качественная реакция на витамин С (аскорбиновая кислота)

Источником витамина С являются овощи и фрукты. Суточная потребность в витамине составляет 70-100 мг.

Аскорбиновая кислота является донором водорода в окислительно-восстановительных реакциях, образуя редокс-пару с дегидроаскорбиновой кислотой. Восстановление дегидроаскорбиновой кислоты в аскорбиновую осуществляется дегидроаскорбатредуктазой с участием восстановленного глутатиона. Биологическое действие аскорбиновой кислоты связано с ее участием в реакциях биологического окисления.

Витамин С защищает гемоглобин, препятствуя его окислению; принимает участие в гидроксилировании пролина, лизина, что повышает прочность коллагеновых волокон; способствует синтезу хондроитинсульфатов соединительной ткани; участвует в обмене аминокислот тирозина и триптофана, стероидов, превращении фолиевой кислоты в коферментную форму, восстановлении Fe³⁺, что облегчает всасывание железа в кишечнике и поступление в ткани.

Дефицит витамина С ведет к цинге. При тяжелых формах заболевания наблюдается нарушение образования коллагена и хондроитинсульфата соединительной ткани. В результате повышаются проницаемость и ломкость капилляров, возникают подкожные кровоизлияния. При недостатке аскорбиновой кислоты снижается возможность использования запасов железа для синтеза гемоглобина в клетках костного мозга и участия фолиевой кислоты в пролиферации кроветворных клеток. Усиливающиеся при этом процессы перекисного окисления липидов вызывают гемолиз эритроцитов. Все это приводит к выраженной анемии. К внешним проявлениям цинги относятся: расшатывание и выпадение зубов, кровоточивость десен, отек и боли в суставах, бледность (анемичность) кожных покровов, подкожные кровоизлияния, поражение костей, замедление заживления ран.

Качественные реакции на аскорбиновую кислоту основаны на ее способности легко окисляться и восстанавливать такие вещества, как железосинеродистый калий, метиленовую синь, молекулярный йод, 2,6-дихлор-фенолиндофенол и др.

Ход работы

4.5.1. В 2 пробирки наливают по 1 капле 5% раствора железосинеродистого калия и по 1 капле 1% раствора хлорного железа.

В первую пробирку к зеленовато-бурой жидкости добавляют 5-10 капель 1% раствора аскорбиновой кислоты.

Во вторую – столько же дистиллированной воды.

Жидкость в первой пробирке приобретает зеленовато-синюю окраску и выпадает осадок берлинской лазури. Во второй пробирке зеленовато-бурая окраска раствора остается без изменений.

Реакция обусловлена окислением аскорбиновой кислоты и восстановлением железосинеродистого калия K₃[Fe(CN)₆] в железистосинеродистый калий K₄[Fe(CN)₆], который с хлорным железом образует берлинскую лазурь Fe₄[Fe(CN)₆]₃.

4.5.2. В 2 пробирки наливают по 1 капле 0,01% раствора метиленовой сини и по 1 капле 10% раствора соды.

В первую пробирку добавляют 3 капли раствора аскорбиновой кислоты.

Во вторую – эквивалентное количество воды и нагревают над пламенем горелки.

В пробирке с аскорбиновой кислотой жидкость обесцвечивается.

4.6. Количественное определение аскорбиновой кислоты

Метод количественного определения аскорбиновой кислоты основан на ее редуцирующих свойствах, в частности способности восстанавливать йодат калия до свободного йода, количество которого определяют титриметрически по реакции с крахмалом.

Ход работы

2-10 г растительного материала измельчают, растирают в фарфоровой ступке с 40 мл дистиллированной воды в течение 10 минут и полностью переносят в мерную колбу на 100 мл. Ступку ополаскивают водой, которую сливают в ту же колбу. Общий объем в мерной колбе доводят до 100 мл дистиллированной водой и фильтруют раствор в сухой стаканчик или колбу.

В конические колбочки емкостью 100 мл наливают 10 мл фильтрата, 1 мл 2% раствора HCI, 0,5 мл 1% раствора KI и 2 мл 0,5% раствора крахмала. Смесь доводят водой до 20 мл, перемешивают и титруют из микробюретки 0,01N раствором йодата калия до устойчивого синего окрашивания. Все операции по определению аскорбиновой кислоты следует проводить быстро (в течение 10 минут). Параллельно осуществляют контрольное титрование смеси реактивов, при этом вместо 10 мл фильтрата в пробу вносят 10 мл воды.

Вычисляют результаты по разности количества 0,01N раствора йодата калия, затраченного на титрование контрольной и опытной проб. Например, если разница при титровании составляет 2 – 1 = 1 мл 0,01N раствора йодата калия, то количество аскорбиновой кислоты равно 1 × 0,088 = 0,088 мг в 10 мл или 0,88 мг в 100 мл вытяжки (исходя из того, что 1 мл 0,01N йодата калия соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты). Далее производят расчет количества витамина С в 100 г продукта, учитывая навеску растительного материала.

5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА

Отчет составляется с указанием цели, задания, включает уравнения протекания реакций, экспериментальные данные и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

6.1. Что такое витамины? Какова их биологическая роль?

6.2. По какому принципу классифицируются витамины? Какие классы витаминов при этом выделяют? Перечислите витамины, относящиеся к каждому из указанных Вами классов.

6.3. Дать понятие «авитаминозы» и «гиповитаминозы». Каковы причины их возникновения?

6.4. Что является источниками витаминов?

6.5. Как можно оценить витаминную обеспеченность организма?

6.6. В состав каких коферментов входят тиамин, рибофлавин, пиридоксин, ниацин? В каких реакциях метаболизма участвуют эти коферменты?

6.7. С помощью каких качественных реакций можно обнаружить присутствие тиамина, рибофлавина, ниацина, пиридоксина, аскорбиновой кислоты? В чем заключается механизм данных реакций?

6.8. Какие свойства аскорбиновой кислоты составляют основу метода ее количественного определения? В чем заключается принцип этого метода?

Тема: ЖИРОРАСТВОРИМЫЕ ВИТАМИНЫ 1. ЦЕЛЬ Изучить качественные реакции жирорастворимых витаминов. 2. ЗАДАЧИ 2.1. Провести качественные реакции на жирорастворимые витамины;· Витамин А (ретинол)· Витамин Д (эргокальциферол)· Витамин К (филлохинон)· Витамин Е (токотриенол)2.2. Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ К жирорастворимым витаминам относятся витамины А (ретинол), Д (эргокальциферол), Е (токотриенол), К (филлохинон), Q (убихинон), F (комплекс ненасыщенных жирных кислот – линолевой, линоленовой и арахидоновой). Витамины, растворимые в жирах, могут накапливаться в организме человека, и поэтому кратковременный дефицит их поступления не приводит к каким-либо неблагоприятным последствиям. Витамины А (ретинол). Биологически активный витамин А содержится только в животных продуктах. В настоящее время выделены два вещества, обладающие активностью витамина А: витамин А₁ – из печени морских рыб и витамин А₂ - из печени пресноводных рыб. Витамин А₂ отличается от витамина А₁ наличием дополнительной двойной связи в кольце (между 3 и 4 углеродными атомами). В растениях содержатся пигменты, которые являются провитаминами витамина А. В животных организмах под влиянием фермента каротинокиназы они превращаются в витамин А. К ним относится каротин – желтый пигмент растений. Витамин А в организме принимает участие в образовании зрительного пурпура – родопсина. Кроме того, он поддерживает стабильность клеточных мембран Витамин Д является производным циклопентанпергидро-фенантрена. Выделено несколько веществ, обладающих активностью витамина Д. Наиболее распространены витамин Д₂ – эргокальциферол и витамин Д₃ – холекальциферол. Биологически активный витамин Д содержится только в животных продуктах. Провитамином витамина Д₂ является эргостерол. Он содержится в грибах и дрожжах. Провитамином витамина Д₃ является холестерол – он содержится в коже. Провитамины превращаются в витамины под действием ультрафиолетовых лучей. Витамин Д в живых организмах участвует в процессе костеобразования, так как влияет на обмен кальция и фосфора, а также на группу ферментов, осуществляющих всасывание кальция. При его недостатке кости становятся мягкими и искривляются: Витамин Е (токоферол) существует в виде нескольких изомеров: α-, β- и γ- токоферолов. Они отличаются друг от друга порядком расположения метильных групп в бензольном ядре. При недостатке витамина Е нарушаются процессы размножения, наступает бесплодие. Витамин Е оказывает влияние на окислительные процессы в организме, принимая участие в окислительно-восстановительных реакциях, связанных с окислительным фосфорилированием. Кроме того, он является прекрасным природным антиокислителем и стабилизирует витамин А.Витамин К (филлохинон) является производным нафтохинона. Существует два природных вещества, обладающих активностью витамина К – К₁ и К₂. В живых организмах витамин К входит в состав простетической группы ферментов, участвующих в биосинтезе протромбина.Он участвует также в регуляции процессов фосфорилирования. Искусственно синтезирован викасол, который является производным витамина К₃ (метилбензохинона). Для обнаружения витаминов применяют качественные реакции. Они основаны на цветных реакциях, характерных для группировок, входящих в состав витаминов. 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 4.1. Качественные реакции на витамин А

Наиболее богаты витамином А печень морских рыб, крупного рогатого скота и свиней, яичный желток, молочные продукты, морковь, томаты, свекла, салат. В овощах витамин А содержится в виде провитаминов – каротинов, которые в организме превращаются в ретинол. Суточная потребность в витамине А – 1-2,5 мг ретинола или 2-5 мг каротина.

Витамин А и его производные (ретиналь, ретиноевая кислота) регулируют рост и дифференцировку клеток развивающегося организма (эмбриона, молодого организма), деление и дифференцировку быстропролиферирующих тканей (хряща, костной ткани, эпителиальных клеток кожи и слизистых, сперматогенного эпителия и плаценты, что делает его необходимым для осуществления нормальной репродуктивной функции). Окисленная форма ретинола – цис-ретиналь – принимает участие в акте зрения в качестве небелкового компонента родопсина.

Наиболее ранними признаками недостаточности ретинола является нарушение темновой адаптации (сумеречная или ночная слепота – гемералопия или никталопия). При гиповитаминозе возникают также уменьшение массы тела, остановка роста (в молодом возрасте), пролиферация и ороговение эпителия (фолликулярный гиперкератоз), сухость кожи и слизистых, слущивание эпителия, нарушение репродуктивной функции, сухость конъюктивы глаза (ксерофтальмия), помутнение и размягчение роговицы (кератомаляция).

4.1.1. Реакция с серной кислотой

Ход работы

На сухое часовое стекло наносят 5 капель масляного раствора ретинола ацетата в хлороформе и 1 каплю концентрированной серной кислоты, в результате чего образуется красно-фиолетовое или красно-бурое окрашивание.

4.1.2. Реакция с хлоридом железа

Ход работы

В сухую пробирку вносят 1 каплю раствора ретинола ацетата и 5 капель хлороформа. Перемешивают и добавляют 3 капли хлорида железа. Отмечают появление желто-зеленого окрашивания.

4.2. Качественные реакции на витамин Д (эргокальциферол и холекальциферол)

Витамин Д – групповое обозначение нескольких веществ, относящихся по химической природе к стеринам. Существуют несколько витамеров витамина Д. Среди них наиболее активны эргокальциферол (Д₂), холекальциферол (Д₃) и дигидроэргокальциферол (Д₄). Витамин Д₂ образуется из растительного предшественника – эргостерина, а Д₃ – из 7-дегидрохолестерина. Таким образом, эргостерин и 7-дегидрохолестерин являются провитаминами. Образование холекальциферола может происходить в коже человека и животных после их облучения ультрафиолетовым светом. Это объясняет тот факт, что дефицит витамина Д чаще встречается в северных широтах и зимой.

Витамин Д содержится в ряде продуктов животного происхождения (печень, молоко, дрожжах и др.) и растительном масле. Наиболее богата им печень рыб. Суточная потребность в данном витамине составляет для детей 12-25 мкг, а для взрослых – значительно меньше, однако потребность в витамине может возрастать у пожилых людей, ведущих домашний образ жизни или прикованных к постели и не подвергавшихся воздействию солнечного света.

Холекальциферол обладает малой активностью. Повышение его активности осуществляется за счет реакций гидроксилирования, протекающих в печени и почках. В печени образуется главная транспортная форма витамина Д – 25-гидроксихолекальциферол (25(ОН)Д₃), доставляемая током крови в почки, где происходит образование производного 1,25-дигидрок-сихолекальциферола или кальцитриола (1,25(ОН)₂Д₃), обладающего гормональной активностью. Действие кальцитриола направлено на регуляцию фосфорно-кальциевого обмена. Это единственный регулятор перемещения кальция через мембрану энтероцитов против градиента концентрации. Он также стимулирует биосинтез в энтероцитах кальцийсвязывающего белка, что обеспечивает всасывание кальция и фосфатов в тонком кишечнике; усиливает реабсорбцию этих ионов в почечных канальцах. Следует отметить также, что обнаруженный витамин Д-зависимый сывороточный фактор активизирует поглощение кальция костной тканью. Все это способствует поддержанию нормального соотношения кальция и фосфора в плазме и внеклеточных жидкостях, что обеспечивает кальцификацию молодой растущей ткани.

Недостаток витамина Д в организме детей приводит к развитию рахита. При этом наблюдается: нарушение минерализации костей, что приводит к их деформации; позднее развитие зубов, гипотония мышц. У взрослых недостаток витамина Д проявляется размягчением костей (остеомаляцией), их хрупкостью (остеопорозом), возникающих вследствие вымывания из костной ткани солей кальция и фосфора.

Ход работы

4.2.1. В сухую пробирку вносят 1-2 капли раствора рыбьего жира и 1-2 капли раствора брома в хлороформе (1:60). Жидкость постепенно приобретает зеленовато-голубоватый цвет.

4.2.2. К 2 каплям рыбьего жира приливают 2-3 капли хлороформа и 1 каплю концентрированной серной кислоты, что вызывает ярко-желтое, постепенно переходящее в буро-красное окрашивание.4.3. Качественные реакции на витамин Е (токоферол) 4.3.1. Реакция с хлоридом железа (III) В сухую пробирку вносят 4-5 капель 0.1%-ного спиртового раствора α-токоферола, прибавляют 0.5 мл 1%-ного хлорида железа (III) и тщательно перемешивают. Раствор в пробирке приобретает красный цвет в результате окисления α-токоферола хлоридом железа (III) в α-токоферилхинон.4.3.2. Реакция с концентрированной азотной кислоты В сухую пробирку вносят 4-5 капель 0.1%-ного спиртового раствора α-токоферола, прибавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты и тщательно перемешивают. Образуется эмульсия, которая при стоянии расслаивается. При этом ее верхний слой приобретает желтовато-красную или красную в результате окисления α-токоферола в α-токоферилхинон.4.4. Качественные реакции на витамин К (викасол) 4.4.1. Реакция со щелочным раствором цистеина В сухую пробирку вносят 5 капель 0.1%-ного спиртового раствора викасола, добавляют 2 капли 0.02%-ного раствора цистеина, 2 капли 10%-ного раствора гидроксида натрия и тщательно перемешивают. Раствор в пробирке приобретает лимонно-желтый цвет.4.4.2. Реакция с анилином В сухую пробирку вносят 10 капель 0.1%-ного спиртового раствора викасола, добавляют 5 капель раствора анилина и перемешивают. Раствор в пробирке приобретает красный цвет. 5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, экспериментальные данные и выводы. 6. ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

6.1. Какова биологическая роль витаминов А, Д и К. Какие патологические состояния возникают при их дефиците в пище? Назовите основные симптомы этих заболеваний.

6.2. Какова биологическая роль витамина Е? Как изменится потребность в данном витамине при увеличении потребления растительных жиров, содержащих большое количество ненасыщенных жирных кислот?

6.3. Почему у новорожденных детей может развиваться геморрагический синдром?

6.4. Что такое провитамины? Назовите вещества, являющиеся провитаминами ретинола и кальциферола.

6.5. Почему у больных, прикованных к постели увеличена потребность в кальцифероле?

6.6. Почему при заболеваниях печени или почек у больного наблюдаются симптомы остеопороза?

6.7. С помощью каких реакций можно обнаружить ретинол, кальциферол, токоферол, викасол? Какие изменения наблюдаются в присутствии перечисленных витаминов в анализируемой жидкости?

6.8. Какие разновидности витамина К Вы знаете? В чем заключается отличие викасола от природных витаминов К? При каких патологических состояниях рекомендуется введение викасола? Какова его суточная доза при этом?

Тема: ВВЕДЕНИЕ В ОБМЕН ВЕЩЕСТВ. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

1. ЦЕЛЬ

Количественное определение АТФ и креатинфосфата в мышцах.

2. ЗАДАНИЕ

2.1. Количественное определение АТФ и креатинфосфата в мышцах

2.2.Сделать выводы и оформить отчет. 3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения – АТФ и креатинфосфат, которые обеспечивают по мере надобности мышцу энергией. Метод их определения в мышечной ткани основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, как и фосфатный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде – это так называемый лабильно связанный фосфор.

Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфата, которое приходится на макроэргические соединения мышечной ткани. Количество неорганического фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

4. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

4.1. Количественное определение АТФ и креатинфосфата в мышцах

Ход работы

0,5 г мышечной ткани гомогенизируют на льду с 5 мл охлажденного 2,5% раствора трихлоруксусной кислоты и фильтруют в мерную пробирку. Осадок на фильтре промывают 5 мл холодной дистиллированной воды, после чего доводят объем раствора до 10 мл. В две пробирки отмеривают по 0,5 мл безбелкового фильтрата мышц и добавляют по 1 мл 1М раствора соляной кислоты. Первую пробирку (опытную) кипятят 10 минут на водяной бане. Вторую пробирку (контрольную) кипячению не подвергают.

Дальнейшие процедуры с опытной и контрольной пробами проводят обязательно одновременно. После охлаждения в обе пробирки приливают по 1 мл 1М раствора едкого натра и 7,5 мл дистиллированной воды. Растворы в пробирках тщательно перемешивают и отмеривают по 0,5 мл жидкости в две другие пробирки, куда затем добавляют по 0,5 мл 1% раствора молибдата аммония, 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты и 2 мл дистиллированной воды.

Смесь в пробирках перемешивают и выдерживают 10 минут при комнатной температуре, после чего колориметрируют при длине волны 670 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против дистиллированной воды.

В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфат представляет собой сумму лабильно связанного фосфата и фосфатных солей, присутствующих в ткани; в контрольной пробе присутствуют только фосфатные соли.

Из оптической плотности, найденной для опытной пробы, вычитают оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Количество лабильно связанного фосфора находят по калибровочному графику, который строят, измеряя экстинкцию стандартных растворов неорганического фосфора, обрабатывая их таким же образом, как и опытную пробу.

Количество лабильно связанного фосфора рассчитывают, учитывая разведение, по формуле:

Х = А × 3,3 × 400 × 100,

где Х – содержание макроэргических соединений в пересчете на 1 мг АТФ в 100 г сырой ткани (мг/100 г); А – содержание АТФ в пробе, мг; 3,3 × 400 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов. 5. СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА Отчет составляется с указанием цели, задания, включает условия протекания реакций, экспериментальные данные и выводы.

ВОПРОСЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ

6.1 Какие термодинамические параметры системы определяют направление протекания химической реакции? Как они изменяются при самопроизвольном течении процесса?

6.2. Что такое открытая система? Основное условие существования открытых систем?

6.3. Что такое метаболизм? Из каких процессов он складывается?

6.4. Какие биологические функции выполняет метаболизм?

6.5. Что такое общие и специфические пути метаболизма?

6.6. Какие пути образования АТФ Вам известны? В чем их отличие друг от друга?

6.7. Какие соединения называются макроэргическими? Дайте понятие макроэргической связи.

6.8. Какие типы макроэргических соединений Вы знаете? Приведите примеры макроэргических соединений.

6.9. Что такое субстратное фосфорилирование? Какая форма свободной энергии используется в реакциях субстратного фосфорилирования?

6.10. Что такое окислительное фосфорилирование? Где в клетке оно имеет место?

6.11. Какие макроэргические соединения образуются в мышцах?

6.12. На чем основан метод определения лабильно связанного фосфата в мышечной ткани?

Приложение 1. ТЕХНИКА БЕЗПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИОБЩИЕ ПРАВИЛА 1. Все работы в лаборатории проводить в рабочей одежде – халате.2. При пользовании реактивами обращать внимание на надписи на этикетке.3. Не пробовать на вкус или на ощупь неизвестные вещества.4. Не производить смешивания веществ, результаты реакций между которыми не известны.5. Работу с выделением ядовитых газов и с сильно пахнущими веществами производить в вытяжном шкафу.6. Не следует вдыхать выделяющиеся газы непосредственно из пробирки или направлять их в лицо.7. Ввиду того, что водород, метан, этилен и ацетилен образуют с воздухом взрывчатые смеси, нельзя поджигать их у отверстия газоотводной трубки, не убедившись предварительно, что воздух полностью вытеснен из пробирки.8. Не принимать пищу на рабочем месте и во время работы.9. При возникновении пожара в лаборатории тушить его, прикрыв пламя тряпкой, асбестовым одеялом или засыпав песком. Ящики с песком должны быть в каждой лаборатории. Знать места расположения огнетушителей.10. После работы поставить все реактивы на место, вымыть посуду, убрать рабочий стол.11. В конце работы обязательно вымыть руки.12. Любая работа заканчивается протоколированием результатов произведенных исследований. Приложение 2. РАБОТА СО ЩЕЛОЧАМИ, КИСЛОТАМИ И ПРОЧИМИ СИЛЬНОДЕЙСТВУЮЩИМИ И ЯДОВИТЫМИ РЕАКТИВАМИ 1. Набирать реактивы пипеткой из бутыли только в том случае, если сосуд наполнен не меньше чем наполовину.2. При заборе реактива погружать пипетку до самого дна склянки, летучие кислоты не насасывать ртом, а пользоваться баллоном или автоматической пипеткой.3. Во время заполнения пипетки не отвлекаться – смотреть только на пипетку.4. После отмеривания реактива не класть использованную пипетку на стол, а опустить ее в сосуд для промывания.5. Все работы с использованием кислот, щелочей и других сильнодействующих реактивов производить чрезвычайно осторожно и внимательно.6. Если реактив попадает в рот или на кожу, промывать пораженное место водой, а затем нейтрализовать 3% раствором соды в случае кислоты или 3% раствором уксусной кислоты в случае щелочи.7. Если реактивы прольются на стол, нейтрализовать кислоту содой, а щелочь уксусной кислотой, а затем вымыть стол водой.

---

Дата добавления: 2015-07-08