Проведение сигналов с рецепторов лимфоцитов для антигенов — TCR и BCR

Для Рц лимфоцитов для Аг — TCR и BCR — описан ряд общих закономерностей восприятия и проведения активационных сигналов в клетку (рис. 6.2).

Рис. 6. 2. Взаимодействия внутриклеточных молекул, участвующих в проведении сигналов с рецепторов для антигена (на примере TCR) на ядро (гены) T–лимфоцита (схема). TCR кластеризован — это непременное условие продуктивной активации лимфоцита. CD45 — трансмембранная тирозинфосфатаза, отщепляет ингибирующие фосфаты от ITAM цитоплазматических участков цепей комплекса TCR, чем способствует активации внутриклеточных тирозинкиназ семейства Src (Fyn и Lck). Киназы Src конститутивно ассоциированы с одной стороны с клеточной мембраной, с другой — с проводящими сигнал участками цепей TCR. ZAP–70 — z–associated protein–70 — тирозинкиназа с молекулярной массой 70 кД, ассоциированная с z–цепью комплекса TCR. LAT — один из адапторных белков, связывающих активированную киназу ZAP–70 с киназами Tec, активирующими дальше фосфолипазу C–г (PLCr). PLCr расщепляет фосфатидилинозитолдифосфат клеточной мембраны (PIP₂) на диацилглицерол (ДАГ), который остаётся в мембране, и фосфатидилинозитол трифосфат (PIP₃), который уходит внутрь клетки и участвует в высвобождении Ca²⁺ из депо, участвующих в дальнейших реакциях активации. PKC — протеинкиназа С, которую активирует ДАГ. NFkB — ядерный фактор транскрипции каппа В. NFAT — nuclear factor of activated T–cells — ядерный фактор транскрипции активированных T–лимфоцитов. АP–1–фактор транскрипции — димер генрегулирующих белков Fos и Jun.

· Лиганд(ы) связывают несколько одноимённых Рц в кластеры (кластеризация Рц в мембране). Без кластеризации изменение конформации от «одновалентного» взаимодействия Рц–лиганд количественно недостаточно для наступления последствий на уровне всей клетки*.

Большинство препаратов Аг, используемых в экспериментах, являются мономерными и растворимыми. Однако на практике на них легко удаётся получить гуморальный иммунный ответ — выработку АТ в организме животного. Сами по себе такие Аг, очевидно, не могут вызвать кластеризацию BCR. Поэтому предполагают, что происходит следующее. BCR связывает Аг и наступает опосредованный через Рц эндоцитоз Аг. Внутри клетки Аг расщепляется, и пептидные фрагменты образуют комплексы с молекулами MHC, в таком виде экспрессируются на мембрану. B–лимфоцит начинает выступать в роли АПК для T–лимфоцита. T–лимфоцит связывает кассеты этих комплексов на поверхности B–лимфоцита, между ними формируется иммунологический синапс, и T–лимфоцит посылает B–лимфоциту необходимый для запуска продукции АТ «второй сигнал». Такое представление объясняет механизм давно известной тимусзависимости гуморального иммунного ответа на большинство белковых антигенов.

· Значительная часть биохимических реакций проведения сигнала — фосфорилирование молекул белков по остатку тирозина под действием протеин–тирозинкиназ или дефосфорилирования белков под действием фосфатаз. Изменение статуса остатков тирозина по фосфорилированности приводит к активации или инактивации белка. Процессы фосфорилирования–дефосфорилирования белков легко обратимы, осуществляются без дополнительных синтезов белков и поэтому «удобны» для быстрых и гибких адаптивных реакций клетки на внешние сигналы.

· В цитоплазматических участках сигналпроводящих цепей Рц выявлены определённые последовательности АК, содержащие остатки тирозина. Эти последовательности назвали ITAM (immunoreceptor tyrosine–based activation motifs — тирозинсодержащие активационные последовательности АК в иммунорецепторах) для активирующих сигналов и ITIM для подавляющих активность клетки сигналов. ITAM содержат 2 остатка тирозина, разделённых 9–12 АК: ...YXX[L/V]X_6–9 YXX[L/V]..., где Y — остаток тирозина, X — остатки разных АК, L — остаток лейцина, V — остаток валина.

à В одном BCR содержится всего две последовательности ITAM — по одной в цитоплазматических концах молекул Iga и Igb. Именно в этих цепях — Iga и Igb — ITAM впервые и идентифицировали. В одном TCR содержится 10 последовательностей ITAM (по 1 в g-, d- и 2 e–цепях, по 3 в каждой из 2 z–цепей).

à Первыми, «обслуживают» TCR/BCR внутри клетки протеин–тирозин киназы семейства Src (читают «сарк»). Эти киназы связаны с внутренней стороной клеточной мембраны через липидные мостики, а также они «заранее» связаны низкоаффинно с ITAMs в цитоплазматических участках цепей Рц. Тирозинкиназы этого семейства характерны для разных сигналов, инициирующих деление и дифференцировку клеток. Название произошло от «вируса саркомы Рауса», потому что изначально эти киназы открыли как продукты онкогена этого вируса (v–src). Затем был открыт клеточный ген–прототип (c–src). Киназы Src фосфорилируют ITAM в цитоплазматических концах цепей Рц. Фосфорилирование по тирозину так меняет молекулу белка, что в ней возникают места, способные связывать другие белки. Запускаются «белок–белковые взаимодействия». Охарактеризованы два варианта мест связывания белков с белками: SÍ2–домен (Src homology 2) и SÍ3–домен (Src homology 3); SÍ2–домен связывает другие белки по фосфотирозину, SÍ3–домен связывает другие белки по участкам, богатым пролином.

Ú В B–лимфоцитах работают Src–киназы Fyn, Blk и Lyn, а в T–лимфоцитах — Src –киназы Fyn и Lck. В T–лимфоцитах киназа Lck конститутивно ассоциирована с цитоплазматическими доменами корецепторов CD4 и CD8, а киназа Fyn после кластеризации TCR ассоциируется с z и e–цепями.

Ú Ферментативная активность самих киназ семейства Src зависит от фосфорилированности киназного домена и C–концевого участка молекулы: фосфорилирование остатка тирозина в киназном домене приводит фермент в активное состояние, фосфорилирование остатка тирозина в C–концевом участке инактивирует фермент. Фосфорилирование в C–конце осуществляет специальный фермент — киназа Csk. Этa киназа конститутивно активна в неделящихся клетках. Противодействует киназе Csk трансмембранная тирозин–фосфатаза CD45, которая удаляет фосфат с остатка тирозина в C–конце молекул киназ семейства Src. Молекула CD45 была открыта как «общий Аг всех лейкоцитов». Таким образом, от баланса активностей киназы Csk и фосфатазы CD45 зависит, наступит или нет активация лимфоцита после агрегации его Рц для Аг. Через экспрессию разных изоформ фосфатазы CD45 регулируется порог силы сигнала, активирующего T–лимфоцит. В иммунных T–лимфоцитах и T–лимфоцитах памяти экспрессирована изоформа CD45, уже ассоциированная с цепями TCR, и порог активации иммунных T–лимфоцитов существенно ниже, чем у неиммунных T–лимфоцитов, в которых экспрессируется иная изоформа CD45 — не предассоциированная с TCR.

à Второй известный молекулярный механизм регуляции активности киназ семейства Src в клетке — это их ковалентное связывание с убиквитином через адапторный белок Cb1.

Ú Связывание с убиквитином «направляет» всякий белок на деградацию в протеасомах.

Ú Совместная агрегация Рц лимфоцитов для Аг с корецепторами (TCR с CD4 или CD8 и BCR с «CD19, CD21, CD81») значительно снижает порог чувствительности лимфоцита к активации: при наличии корецепторов для активации T–лимфоцита достаточно связать 100 одинаковых комплексов пептид–MHC, в отсутствие корецепторов необходимо не менее 10 тыс. таких комплексов, что в естественных условиях, по-видимому, не встречается. Агрегация BCR с корецепторами «CD19, CD21, CD81» снижает порог чувствительности B–лимфоцита по показателю концентрации Аг в 1000–10 000 раз.

· С фосфорилированными ITAM в цитоплазматических участках цепей Рц начинают взаимодействовать тирозинкиназы следующего этапа проведения сигнала — Syk в B–лимфоцитах и ZAP–70 в T–лимфоцитах. Киназа Syk встречается только в кроветворных клетках, киназа ZAP–70 — только в T–лимфоцитах. Обе эти киназы имеют по два домена SH2 в N–конце молекулы. Киназная активность локализована в C–конце.

à ZAP–70 активируется фосфорилированием ассоциированной с корецепторами T–лимфоцита Src–киназой Lck. Будучи активированной, ZAP–70 фосфорилирует свои субстраты — два адапторных белка LAT и SLP–76 (аналоги в B–лимфоцитах соответственно BLNK и SLP–65). Эти адапторные белки связаны с богатыми холестеролом участками внутренней стороны клеточной мембраны через липидные мостики (пальмитоилированные остатки цистеина). Физическая ассоциация проводящих сигнал компонентов с клеточной мембраной обеспечивает распространение сигнала не только внутрь клетки, но и вдоль мембраны.

· На этом этапе происходит активация киназ ещё одного семейства, встречающегося только в лимфоцитах — это киназы Tec. В B–лимфоцитах экспрессируется киназа Брутона — Btk*, в T–лимфоцитах — киназа Itk. В молекулах этих киназ есть участки, так называемые домены PH (pleckstrin–homology), позволяющие этим белкам связываться с фосфорилированными липидами внутренней стороны клеточной мембраны. Через свои SH2- и SÍ3–домены они связывают адапторные белки LAT, SLP–76, BLNK. Киназы Tec являются важными активаторами следующего участника проведения сигнала — фосфолипазы C–g.

Киназа Брутона Btk (Bruton's tyrosine kinase) — «знаменита» тем, что именно дефект в гене этого фермента обнаружен у пациентов с первичным иммунодефицитом — агаммаглобулинемией Брутона. Это заболевание — первое, открытое врачами (О.С. Брутоном в 1952 г.) — из категории врождённых генетических иммунодефицитов.

· Молекула фосфолипазы C–g (PLC–g) содержит два домена SH2, через которые она связывается с фосфотирозинами на активированных тирозинкиназах, фосфорилирующих активационные остатки тирозина в молекуле PLC–g. Будучи активированной, PLC–g начинает расщеплять фосфолипиды клеточной мембраны, а именно фосфатидилинозитолдифосфат (PIP₂) на фосфатидилинозитолтрифосфат (PIP₃) и диацилглицерол (ДАГ).

à Для PIP₃ есть Рц в эндоплазматическом ретикулуме, он связывается с PIP₃ и тем самым высвобождает ионы кальция из депо в цитозоль. В процесс активации клетки включаются и кальциевые насосы клеточной мембраны, «подкачивающие» Ca²⁺ из внеклеточной среды. Свободный кальций, будучи в достаточной концентрации, активирует кальцийсвязывающие белки, в том числе кальмодулин, который регулирует активность ряда других белков. В высоких концентрациях Ca²⁺ активирует и серин/треониновую фосфатазу — кальцийнейрин, который дефосфорилирует и тем самым активирует фактор транскрипции NFAT (nuclear factor of activated T cells; несмотря на такое название, этот фактор транскрипции не является специфичным только для T–лимфоцитов).

· ДАГ остаётся в мембране и активирует протеинкиназу С (PKC) — серинтреониновую киназу, которая активирует эволюционно «древний» фактор транскрипции NFkB.

· Следующие участники проведения сигнала — малые G–белки. Это небольшие одноцепочные белки, обладающие свойством связываться с гуанозинтрифосфатом (ГТФ). Первый из открытых малых G–белков — Ras (мол. масса 21 кДа). Он был открыт как непременный участник клеточного деления, консервативный у всех исследованных эукариотических клеток.

à Существенные участники процессов передачи сигнала — так называемые адапторные белки. Это белки, содержащие от 1 до 3 SH2- и SH3–доменов, по которым они связывают другие белки, чем обеспечивают нужные белок–белковые взаимодействия. Одним из лигандов адапторных белков являются факторы замещения гуаниннуклеотидов — GEFs (guanine–nucleotide exchange factors). Ras в неактивном состоянии содержит ГДФ. GEF из адапторного белка заменяет в Ras ГДФ на ГТФ, чем переводит Ras в активное состояние. Ras, однако, обладает собственной ГТФ–азной активностью и быстро отщепляет третий фосфат, чем возвращает себя в неактивное состояние (самоинактивируется). Описаны мутации в гене Ras, приводящие к замене всего одной АК, но с потерей способности самоинактивироваться. Клетки с таким мутантным геном становятся злокачественно опухолевыми.

à В состоянии кратковременной активации Ras успевает активировать очередной каскад киназ, называемый MAP (Mitogen–Activated Protein Kinase). Именно эти киназы MAP уже непосредственно фосфорилируют факторы транскрипции в адре клетки. В настоящее время охарактеризован фактор транскрипции АP–1 — гетеродимер белков Fos и Jun.

· Изучение внутриклеточных молекулярных механизмов действия таких иммунодепрессивных ЛС, как циклоспорин А, такролимус (FR506) и сиролимус, привело к обнаружению в клетке так называемых иммунофилинов. Иммунофилинами назвали те молекулы в клетке, с которыми указанные иммунодепрессанты вступают в непосредственное химическое взаимодействие: циклоспорин А образует комплекс с иммунофилином, названным циклофилином, такролимус — с иммунофилином FKBP (FK–Binding Protein). Иммунофилины являются ферментами — пептидил–пролил– cis–trans –изомеразами. Биологические эффекты циклоспорина А и такролимуса одинаковы: образующиеся в клетке комплексы «иммунофилин–препарат» связывают и инактивируют кальцийнейрин. В результате не активируется фактор транскрипции NFAT и не наступает транскрипция с генов ИЛ–2, CD40–лиганд, Fas–лиганд и T–лимфоцит не выходит в активацию, не наступает экспансия клона. Кальцийневрин функционирует не только в T–лимфоцитах, но и в других клетках, однако его концентрация в других клетках существенно выше, чем в T–лимфоцитах. Это и позволяет подавить активацию T–лимфоцитов дозами препаратов, к которым устойчивы другие клетки. У сиролимуса иной внутриклеточный механизм действия, чем у циклоспорина и такролимуса. Сиролимус связывается с тем же иммунофилином, что и такролимус, — FKBP, но этот комплекс не затрагивает кальцийнейрин. Комплекс сиролимус—иммунофилин связывается в клетке с некой протеинкиназой, названной mTOR (Mammalian Target Of Rapamycin) и блокирует проведение сигналов с Рц для ИЛ–2, ИЛ–4 и ИЛ–6 — соответственно блокируются пролиферация и иные проявления активации, зависящие от этих Рц.

à То, что у циклоспорина А и такролимуса, с одной стороны, и у сиролимуса — с другой разные внутриклеточные механизмы действия, позволяет использовать их комбинации в клинике с существенным снижением дозы с обеих сторон.

Кратко суммируем «ключевые слова», обозначающие процессы и молекулы, осуществляющие внутриклеточное проведение сигналов в лимфоцитах с Рц для Аг:

Ú кластеризация Рц и корецепторов;

Ú ITAM's — 2 в BCR, 10 в TCR;

Ú киназы семейства Src—Fyn, Blk, Lyn — в B–лимфоцитах, Lck и Fyn в T–лимфоцитах;

Ú киназы Syk и ZAP–70;

Ú киназы семейства Tec—Btk, Itk;

Ú фосфолипаза C–g (PLC–g);

Ú фосфатидилинозитол дифосфат (PIP₂), фосфатидилилинозитол трифосфат (PIP₃), диацилглицерол (ДАГ);

Ú ионы кальция (Ca²⁺), кальмодулин, кальцийнейрин, фактор транскрипции NFAT;

Ú протеинкиназа С (PKC), фактор транскрипции NFkB;

Ú малые G–белки (Ras);

Ú каскад киназ MAP;

Ú факторы транскрипции АP–1;

Ú иммунофилины.

Дата добавления: 2015-10-28