Молекулярно-генетические методы

Молекулярные методы стали активно разрабатывать­ся с 70-х гг. XX в. К настоящему времени известно уже достаточно много методов, которые широко используют­ся в медицинской практике. Методы ДНК-диагностики ис­пользуются для изучения структуры участков ДНК-гена или участка хромосомы и позволяют осуществлять точ­ную диагностику многих заболеваний, проводить дородовую диагностику наследственных болезней. Основой ме­тодов являются научные данные о строении и свойствах молекул ДНК и РНК, генах, закономерностях наследова­ния признаков.

Молекулярно-генетические методы позволяют проводить анализ особенностей ДНК, в основе которого находятся две характеристики: последовательность составляющих ДНК элементов, которые имеют индивидуальные особенности у каждого человека, кроме однояйцевых близнецов или кло­нов, и во всех соматических клетках у каждого человека струк­тура ДНК одинакова.

ДНК может быть получена из любой клетки, содержа­щей ядро и может долго храниться. Для этой цели ис­пользуют лейкоциты крови или ворсинки хориона. Иног­да достаточно иметь одну каплю крови, несколько луко­виц волос. Проводить анализы с огромными молекулами ДНК невозможно, поэтому их делят на части и обрабаты­вают различными бактериальными эндонуклеазами. Та­кое «разрезание» молекулы обеспечивается специальными биологическими «ножницами» — рестриктазами. Суще­ствует много видов рестриктаз. Особенностью каждого вида является способность разрывать молекулу ДНК в местах строгой определенной последовательности нуклеотидов. В результате такого разрезания образуются фраг­менты разного размера, которые специфичны для конк­ретной рестриктазы из-за неоднородности ДНК по соста­ву по всей длине. С помощью электрофореза разделяют фрагменты ДНК по размеру и длине. Под действием элек­трического поля фрагменты ДНК перемещаются вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. Затем каж­дый фрагмент занимает определенное положение в виде полосы в конкретном месте геля. Далее сравнивают рас­положение исследуемого отрезка со стандартными отрез­ками ДНК, которые обязательно наносятся на тот же гель. При этом можно оценить размер изученного образца ДНК. Для сравнения и визуального анализа гель обрабатывают специальным красителем, который соединяется с ДНК, и при облучении геля ультрафиолетом фрагменты ДНК видны как красные полоски. Такой гель можно фотографиро­вать, вносить в память.

Для изучения генома человека и диагностики наслед­ственных болезней, таких как фенилкетонурия, талассе-мия, недостаточность альфа-антитрипсина и др., прово­дится определение специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК-генное зондирование или гибридизационный анализ. Регистрация последовательно­стей небольшой длины (30 пар) нуклеотидов проводится с помощью меченых радиоактивных участков ДНК назван­ными зондами. Зонды гибридизовались с изучаемыми участками ДНК.

Этот анализ называется блот-гибридизация по Саузер-ну. После денатурации ДНК одноцепочечные фрагменты переносят на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр в буферном растворе. Агарозный гель с фрагментами ДНК помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концен­трированным солевым раствором. На гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, а сверху помещают сухую фильтровальную бумагу, в которую впитывается солевой раствор. ДНК переносится вместе с раствором, но за­держивается фильтром и практически полностью оказыва­ется на его поверхности. Затем одноцепочечные ДНК фик­сируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

Чтобы выявить нужные фрагменты, проводят гибриди­зацию ДНК с радиоактивным ДНК-зондом или клониро­ванным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последователь­ность зонда должна быть полностью или частично компле­ментарна изучаемому участку геномной ДНК. С помощью радиоавтографии считывают результат гибридизации компле­ментарных цепей радиоактивного ДНК-зонда и фрагмента ДНК: каждая комплементарная зонду последовательность ДНК проявляется в виде радиоактивной полосы.

Разработаны эффективные методы синтеза искусствен­ных ДНК- зондов, которые используются в пренатальной ди­агностике наследственных заболеваний. Для этого из эмб­риональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости плода, выделяют ДНК. Затем гибридизируют ее с помо­щью Саузерн-блоттинга с радиоактивным ДНК- зондом. Аномальный эмбрион легко распознается, так как его ДНК будет гибридизоваться только с ДНК-зондом, комплемен­тарным мутантной последовательности.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод, по­зволяющий обнаружить и многократно копировать (ам-плифицировать) относительно короткие участки ДНК. Для проведения реакции необходимо точное знание нуклеотид-. ной последовательности этого фрагмента ДНК. ПЦР — мно­гоцикловой процесс, напоминающий естественную реплика­цию нуклеиновой кислоты, и включает в себя несколько эта­пов. Первый этап — денатурация белка, исследуемая ДНК нагревается до температуры более 80°С. При этом разруша­ются водородные связи между двумя полинуклеотидными цепочками и нуклеиновая кислота присутствует в растворе в виде отдельных цепей. Второй этап — к определенному участку этих цепей добавляют праймеры — короткие, искус­ственно синтезированные фрагменты ДНК, которые строго комплементарны начальным участкам исследуемого гена. Для осуществления этого присоединения температура сре­ды понижается до 37°С. Праймеры обычно состоят из 15 — 30 нуклеотидов. Третий этап — происходит образование но­вых цепей при участии фермента термостабильной ДНК по-лимеразы, т.е. происходит гибридизация. Процесс проходит при температуре 60—70 °С. В результате удваивается коли­чество исследуемого гена, содержащегося в первоначальном растворе. Затем ДНК опять нагревают, и весь цикл, повторя­ется снова. Происходит множественное копирование старых и новых одноцепочечных молекул.

В настоящее время имеются различные методы выяв­ления мутаций. Их делят на прямые и косвенные. Прямая диагностика мутаций включает ряд методов:

1) Определение нуклеотидной последовательности и вы­явление делеций, замены оснований, и вставки в изуча­емом фрагменте.

Выявление в результате анализа нарушения места ре­стрикции с помощью блот-гибридизации по Саузерну.

Около 50% нуклеотидных замен ведет к изменению ме­ста рестрикции.

3) Проведение аллелоспецифической гибридизации с син­тетическими зондами, что позволяет обнаружить мута­ции в геномной ДНК.

4) Химическое и ферментативное расщепление ДНК в мес­тах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. В ос­нове метода электрофорез двухцепочечной ДНК в нейт­ральном или равномерно денатурирующем геле.

5) Регистрация изменения электрофоретической подвижно­сти мутантных молекул ДНК.

6) Трансляция белкового продукта осуществляется в систе­ме in vitro на основе получения специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов. Синтезируемый бе­лок анализируют с помощью электрофореза. Изменение подвижности белка указывает на наличие мутации. Косвенные методы выявления мутаций применяют в

тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не расшифрована, но известно его положение на гене­тической карте. Техника проведения анализа такая же, как и в прямой диагностике, но добавляются математические расчеты.

Другим типом полиморфизма ДНК являются микроса­теллиты. Это короткие моно-, ди-, три- и тетрануклеотид-ные тандемно повторяющиеся последовательности ДНК. Они используются в качестве маркерных локусов аллельных ва­риантов гена или маркеров дефектных мутаций.

Дата добавления: 2015-10-02