Современные методы анализа хромосом

Цитогенетический метод — микроскопическое изучение хромосом человека. Цитогенетика является важнейшим раз­делом практической медицины. В настоящее время цитогенетический метод применяется для диагностики хромосом­ных болезней, составления генетических карт хромосом, изучения мутационного процесса и других проблем генети­ки человека.

Основные сведения о морфологии хромосом человека по­лучены при изучении их в метафазах митоза и профазе-ме-тафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно высоким. Важнейшие цитогенетические работы выполнены на лимфоцитах периферической крови, поскольку культивирование лимфоцитов в течение 2—3 суток в присутствии фитогемагглютинина позволяет получить множество метафазных пластинок для хромосом­ного анализа. Для анализа чаще всего используют лимфо­циты периферической крови, деление которых можно стимулировать в присутствии фитогемагглютинина, что позво­ляет получить множество метафазных пластинок для хро­мосомного анализа. Цитогенетическому анализу подвергают однослойные метафазные пластинки с раздельно лежащи­ми хромосомами. Для этого делящиеся клетки обрабатыва­ют колхицином и некоторыми другими химическими веще­ствами (гипотоническим раствором солей, метанол-уксусным фиксатором и др.).

Важным этапом цитогенетического анализа является ок­раска полученных препаратов. Ее проводят простыми, диф­ференциальными и флюоресцентными методами.

Простая окраска обеспечивает групповую идентификацию хромосом. Используется она для количественного учета хро­мосомных аномалий при определении мутагенности среды (действие радиации, химических мутагенов и др.). С помо­щью этого типа окраски были открыты многие хромосомные болезни; а также хромосомные аберрации, вызывающие са­мопроизвольные аборты, врожденные пороки развития, кан­церогенез и т.п.

С целью выявления структурной разнородности хромо­сом по длине, что выражается в виде чередования светлых и темных полос (эу- и гетерохроматических районов), применя­ются методы дифференциального окрашивания. Отмечается, что протяженность и рисунок полос специфичны для каждой хромосомы.

Дифференциальное окрашивание хромосом можно прово­дить различными способами. Сначала использовали акрихин-иприт (флюоресцентное алкилирующее вещество (Q-метод)). В дальнейшем был разработан способ окраски хромосом без флюоресцентных красителей. Это — G-окраска (краситель Гим-за). После предварительной инкубации в солевом растворе хро­мосомы обрабатываются протеазой. В результате они приобре­тают сегментированный вид благодаря чередованию темно- исветлоокрашенных участков. Считается, что окрашенные сег­менты — это гетерохроматиновые участки с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные — эухроматино-вые районы с кодирующими последовательностями ДНК (рис. 3.7).

Особенностью хромосом человека является асинхронность (неодновременность) репликации по длине. В каждой хромо­соме есть рано и поздно реплицирующиеся участки. Для вы­явления последовательности репликации применяется 5-бром-дезоксиуридин, являющийся аналогом тимина. Включившие его участки окрашиваются слабо. Для дифференциальной ок­раски сестринских хроматид применяется 5-бром-дизоксиу-ридин. В этом случае вновь образуемая хроматида включит этот аналог тимина и будет окрашена слабо, а другая (старая) окрасится интенсивно (рис. 3.8). Этот метод позволяет выяв­лять участки обмена между сестринскими хроматидами (СХО).

Разрабатываются новые методы изучения хромосом че­ловека. Применяется метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), который дает возможность исследовать от ло­кализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Метод FISH может применять­ся для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах.

Метод генетики соматических клеток. Так как сомати­ческие клетки несут в себе весь объем генетической инфор­мации, это дает возможность изучать на них генетические закономерности всего организма.

В основе метода лежит культивирование отдельных со­матических клеток человека и получение из них клонов, а так же их гибридизацию и селекцию. Соматические клетки обладают такими особенностями: быстро размножаются на питательных средах; легко клонируются и дают генетически однородное потомство; клоны могут сливаться и давать ги­бридное потомство; легко подвергаются селекции на специ­альных питательных средах; клетки человека хорошо и дол­го сохраняются при замораживании.

Соматические клетки человека получают из разных ор­ганов — кожи, крови, костного мозга, но чаще всего исполь­зуют клетки соединительной ткани и лимфоциты крови.

С помощью метода гибридизации соматических клеток выявляется локализация генов в хромосомах, изучаются мета­болические процессы в клетке; исследуются генные мутации, мутагенная и канцерогенная активность химических веществ.

В настоящее время выяснено, что в Х-хромосоме лока­лизовано 95 генов, в 1-й аутосоме — 24 гена. Ген, определяющий группы крови по системе АВО, расположен в 9-й хро­мосоме, группы крови по системе MN — во 2-й хромосоме, а по системе резус-фактора (Rh) — в 1-й хромосоме.

Использование метода гибридизации соматических кле­ток дает возможность изучать механизмы первичного дей­ствия генов и их взаимодействия, что расширяет возможно­сти точной диагностики наследственных болезней на биохи­мическом уровне.

Изучение сверхизменчивых последовательностей ДНК позволяет установить место гена на хромосоме. Учеными установлено, что ген гиперкератоза человека лежит в 17-й хромосоме, а ген болезни Альцгеймера (старческое слабо­умие) — в 21-й хромосоме.

Активно изучается наследование сахарного диабета, ши­зофрении и ряда других заболеваний.

Исследование сверхизменчивых ДНК в клетках опухолей позволяет обнаружить перестройки хромосом на ранних стади­ях развития опухоли, что важно для их ранней диагностики.

В настоящее время современные, более совершенные ме­тоды анализа хромосом позволяют получить генетические карты генома человека с использованием маркерных генов и последних достижений молекулярной генетики, а также выявить причины многих патологических состояний.

Биохимический метод позволяет определять любые ме­таболиты, специфические для конкретной наследственной бо­лезни. Используются современные биохимические методы: электрофорез, хроматография, спектроскопия и др. Иссле­дуются специфические метаболиты, энзимопатии, различ­ные белки. Биохимическому анализу могут подвергаться моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, фибробласты и лимфоциты. Для биохимической ди­агностики используются как простые качественные реакции, так и более точные методы. С помощью тонкослойной хро­матографии мочи и крови можно диагностировать наруше­ние обмена веществ. Для выявления нарушений обмена орга­нических кислот применяется газовая хроматография.

Биохимические методы используются у больных с на­следственным нарушением обмена веществ при появлении таких симптомов, как рвота, судорога, кома, желтуха, спе-пифический запах мочи и пота, остановка роста, нарушение физического развития. Биохимические методы применяются и для диагностики гетерозиготных состояний у взрослых. Понятно, что если в брак вступают гетерозиготные носители какого-либо заболевания, то риск рождения больного ребен­ка в такой семье составит 25 %. Шансы на встречу двух носите­лей одинакового патологического гена выше, если в брак вступают родственники, так как они могут унаследовать один и тот же рецессивный ген от своего общего предка. Предпо­ложить гетерозиготное носительство у женщины можно в случае, когда у женщины родились больные сыновья; жен­щина имеет больного брата или братьев; ее отец поражен наследственной болезнью; у двух дочерей женщины роди­лись больные сыновья.

При помощи биохимических тестов (прием сахара при сахарном диабете, фенилаланина для выявления фенилке-тонурии и т.д.), микроскопического исследования клеток кро­ви и тканей, определения активности фермента, возможно выявление гетерозиготных носителей того или иного забо­левания. Биохимический метод широко применяется в ме­дико-генетическом консультировании для определения рис­ка рождения больного ребенка. Успехи в области биохими­ческой генетики способствуют более широкому внедрению диагностики гетерозиготного носительства в практику. Еще недавно можно было диагностировать не более 10—15 гете­розиготных состояний, в настоящее время — более 200. Од­нако следует отметить, что до сих пор имеется немало на­следственных заболеваний, для которых методы гетерозигот­ной диагностики еще не разработаны.

Дата добавления: 2015-10-02