Реакция нейтрализации по методу цветной пробы.

Цветная проба основана на способности вирусов изменять метаболическую активность зараженных клеток, что определяют по цвету индикатора, содержащегося в среде. В незараженных культурах клеток под влиянием выделяющихся продуктов кле­точного метаболизма рН среды сдвигается в кислую сторону, вы­зывая изменение цвета фенолового красного. В зараженных куль­турах в результате дегенерации клеток их метаболическая актив­ность подавляется, и цвет фенолового красного не изменяется или изменяется частично. Специфические иммунные сыворотки, нейтрализуя вирус, предотвращают угнетение метаболизма кле­ток.

Сущность реакции вирусной нейтрализации в культуре кле­ток.

Специфические антитела прочно соединяются с вирусной частицей, в результате взаимодействия между вирусом и антите­лом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусной частицы с чувствительными клетками. В результате указанного взаимодействия вирус утрачивает способ­ность размножаться в чувствительной к нему биосистеме. В качестве чувствительной биосистемы могут выступать культура клеток, куриный эмбрион, организм чувствительного лабораторного животного.

Перед постановкой реакции готовят вируссодержащую сус­пензию из выделенного возбудителя или из известного лабора­торного штамма {при проведении титрования сывороток). В зави­симости от вида вируса его выращивают в культуре ткани, в ор­ганах лабораторных животных, в курином эмбрионе. Для реакции нейтрализации пользуются культуральные жидкости, суспензии органов лабораторных животных, аллантоисную и амниотиче-скую жидкости куриных эмбрионов.

В зависимости от целей исследования реакция вирусной ней­трализации может ставиться в 2 направлениях:

1. для идентификации вируса.

2. для проведения серологической диагностики вирусных ин­фекционных заболеваний.

Перед постановкой каждого нейтрализационного опыта ви­рус предварительно титруют, определяя его конечное разведение, вызывающее повреждение культуры ткани или инфицирование лабораторных животных, куриных эмбрионов.

Методика подготовки реакции.

Клетки выращивают обычным способом в матрацах до обра­зования сплошного монослоя. Затем их снимают со стекла версе-ном, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин 5—10 мин, ресуспендируют в питательной среде, контролируют на стериль­ность

Титрование вирусов в цветной реакции. Готовят 10-кратные разведения вирусной суспензии на питательной среде, содержа­щей 2% бычьей сыворотки. Каждое разведение вируса вносят в объеме 0,25 мл в 2 пробирки. К ним добавляют по одной дозе клеток в объеме 0,25 мл, 0,25 мл питательной среды и 0,6—0,8 мл вазелинового масла.

В пробирках, содержащих вирус, клетки дегенерируют и цвет среды не изменяется или меняется лишь частично: остается красным или оранжевым. Желтый цвет среды в пробирках свидетель­ствует об отсутствии вируса и наличии живых клеток.

Результаты реакции оценивают по методу Рида — Менча, ус­танавливая то наибольшее разведение вирусной суспензии, кото­рое подавило метаболизм в 50% зараженных пробирок (среда со­хранила красный или оранжевый цвет), и принимая его за одну ЦПД₅о.

Дата добавления: 2015-09-05