РИНГ и теломеры

Почти сразу же параллельно с идентификацией РИНГ как феномена в начале 1990-х гг. было высказано предположение о том, что один из молекулярных механизмов формирования нестабильности связан с нарушениями в теломерных участках хромосом [AS1, AS2].

Теломеры и теломераза. Нормальные клетки организма, достигая возраста физиологического старения (30–50 генераций), перестают размножаться и погибают. Некие «молекулярные часы» отмеряют клеточное время жизни, которое в конечном счете реализуется в продолжительность жизни организма. В начале 1970-х гг. было сделано предположение о роли в этом процессе укорочения хромосом («концевая недорепликация»), объясняющегося тем, что во время репликации ДНК, происходящей в направлении 3' → 5', одна из нитей ДНК (отстающая) не может синтезироваться до конца из-за соответствующего расположения РНК-праймера.

Было обнаружено, что на концах ДНК эукариотических хромосом расположены специфические участки повторов в комплексе с белками, названные теломерами — нуклеотидные последовательности типа (TTAGGG)_n. Общий размер теломерных повторов составляет 12–15 тыс. пар нуклеотидов. Эти последовательности обнаружены у всех эукариот — от дрожжей до человека и сходны по нуклеотидному составу [РК4, AB18, AG12, AG13].

Теломеры необходимы для поддержания стабильности хромосом. Их потеря ведет к аномальному слипанию (соединению) сестринских хроматид[67] и, в конечном счете, к интенсивной амплификации ДНК плюс делециям большого размера [AM57]. Уменьшение длины теломер во время репликации, прямые повреждения их нуклеотидной структуры либо дефекты в белках, связанных с теломерами, приводят к нестабильности хромосом, отмечающейся при старении и в течение процесса иммортализации [РК4, AM8]), хотя имеются и другие мнения (ниже). Согласно [AS4], потеря даже одной теломеры может с течением времени приводить к нестабильности многих хромосом и, затем, к различным типам цитогенетических перестроек и мутаций, связанных с канцерогенезом [AF20, AM57].

Помимо концевых участков, теломерные повторы обнаружены также в субтеломерной и в интерстициальной (внутренней) части хромосом. Часто такие повторы представлены в неполном, дефектном виде [AM24]. Так, в клетках человека интерстициальные теломерные последовательности могут содержать короткие фрагменты повторов (менее 20-ти), или длинные мотивы гексануклеотидов, в основном находящихся в субтеломерах. В геноме человека эти интерстициальные «теломеры» локализованы в хромосоме 2q31 [AD9].

При делении клетки хромосома каждый раз укорачивается на определенное число теломерных повторов, пока длина теломеры не достигнет критической длины порядка 2–3 тыс. пар нуклеотидов. После этого клетка перестает делиться и погибает. В иммортализованных клетках укорочение теломер на определенном этапе приостанавливается (их размер даже незначительно возрастает), и в процессе дальнейшего культивирования происходит постоянное поддержание размера теломеры. За восстановление теломерных последовательностей отвечает фермент теломераза, представляющий собой РНК-белковый комплекс (РНК служит праймером-затравкой для связывания с теломерными повторами) [РК4]. (Существует также «альтернативный механизм» удлинения теломеры, не зависящий от теломеразы [AM58, AS11].)

На рис. 2.3.3 представлена примерная схема, характеризующая активность теломеразы в различных клетках и на разных стадиях клеточного развития. Отражено также состояние теломерных повторов. Схема взята из главы Н.П. Киселевой и Ф.Л. Киселева в монографии авторов из Онконцентра «Канцерогенез» (2000 г.) [РК4].

Рисунок 2.3.3. Функционирование теломеразы и длина теломер в различных клетках и при различных клеточных состояниях [РК4].

Активность теломеразы отсутствует в подавляющем большинстве нормальных клеток человека за некоторым исключением. Фермент обнаружен в стволовых клетках крови, репродуктивных тканях, кератиноцитах, в быстро обновляющихся клетках кишечного эпителия и в некоторых других. Однако в тех случаях, когда теломеразная активность выявляется в нормальных клетках, ее уровень значительно ниже, чем в злокачественных опухолях. В доброкачественных же опухолях этот фермент либо не выявляется вовсе, либо частота его обнаружения там низка [РК4].

В настоящее время теломеразу рассматривают как молекулярный маркер ранних стадий злокачественного новообразования, поскольку считается, что этот фермент играет ключевую роль в переключении генетической программы клеток с апоптоза на иммортализацию [РК4]. Другая роль теломеразы связана с формированием теломер de novo, или с «исцелением» (healing) хромосом путем их стабилизации при повреждениях [AM17, AS37].

Обнаружена способность облучения активировать теломеразу как in vitro [AH23, AN15], так и in vivo [AH6]. Этот процесс зависим от регулятора апоптоза белка TP53 [AN14]. Индуцированная облучением активация теломеразы зависит от мощности дозы, не связана ни с прохождением клеток по циклу, ни с индукцией клеточной гибели, и является, вероятно, следствием специфического регуляторного ответа к облучению [AP6].

Исследования модификации структуры/функций теломер при облучении, а также взаимосвязей таких модификаций с нестабильностью генома, проводятся уже не менее полутора десятков лет, но дело с очередным молекулярным механизмом РИНГ оказалось столь же не ясным, как и с прочими рассмотренными теориями.

Имеются следующие экспериментальные факты «за», и «против», причем и те, и другие — в рамках двух нижепредставленных пунктов.

«За»:

1) Есть связь между структурой/функциями теломер и нестабильностью хромосом.

Зависимой от возраста хромосомной нестабильности сопутствует уменьшение длины теломер [AM8, AS3, AS30]. Это может быть связано с накоплением двунитевых разрывов ДНК [AY3]. Безотносительно возраста нарушения структуры теломер обнаруживаются и при предрасположенности к ракам [AS3]. При лимфоме Ходжкина [AM26] и синдроме Неймегена [AB1] укорочение теломер обусловливает спонтанную нестабильность хромосом и повышение радиочувствительности (связь между длиной теломер и радиочувствительностью описана также в [AM12]). При раках различной этиологии показана частая потеря теломер, которой сопутствует хромосомная нестабильность [AG12, AG13, AS30].

В экспериментах in vitro нестабильные мутантные клоны клеток CHO характеризовались модификацией структуры теломер [AR8].

Потеря единственной теломеры способна приводит к транспорту нестабильности от одной хромосомы к другой, приводя к выраженной нестабильности генома [AM57, AS4].

Ряд свидетельств о том, что дисфункции теломер могут обусловливать увеличение частоты мутаций и нестабильность генома, представлены также в обзорах [AB27, AD27, AF20, AM57].

2) Нестабильность теломер может быть фактором, инициирующим РИНГ

Участие теломерных повторов в РИНГ было впервые описано французскими исследователями Л. Сабатье с соавторами (L. Sabatier et al.) в 1992 г. [AS1, AS2] для облученных радиацией с высокой ЛПЭ фибробластов человека. Было продемонстрировано, что нестабильность, приобретенная хромосомами, включает обратимые ассоциации теломер, не обусловленные их радикальным укорочением [AS2]. В нормальных фибробластах человека рентгеновское облучение (2 Гр) приводило к отсроченным (у клеток-потомков) аномалиям теломер (потери и дупликации), т.е., к РИНГ в теломерных участках [AO3]. Сходным образом, радиация повышала нестабильность теломер (слипание) в клетках мышей, причем в линии scid [68] эффект был выше [AU19].

В клетках с атаксией-телангиэктазией отмечается высокий уровень как спонтанной, так и индуцированной облучением нестабильности теломер [AU4]. Авторы работы [AU4] делают вывод, что теломеры — мишень для индукции РИНГ. Действительно, нестабильность хромосом может быть инициирована двунитевым разрывом, который приводит к потере теломеры и утрате защиты конца хромосомы от предотвращения хромосомного слипания (соединения). Например, единственный двунитевой разрыв, внесенный в область теломеры ДНК клеток эмбрионов мышей [AL31], либо спонтанная потеря теломеры в линии раковых клеток человека [AF23, AL30], приводит к слипанию сестринских хроматид и нестабильности хромосом.

В ряде исследований на модельных клеточных системах продемонстрирована роль в индукции и промоции РИНГ внутрихромосомных, интерстициальных теломерных повторов (см. выше). Так, различные формы постлучевой нестабильности, связанной с теломерами, экспрессировались в гибридных клетках человека — китайского хомячка [AM5], причем в некоторых клонах этих клеток нестабильность хромосом была представлена транслокациями, имеющими в местах соединения интерстициальные последовательности теломер [AD6].

В геноме плодов крысы были обнаружены «горячие точки», которые преимущественно повреждаются при облучении, и 76% этих точек локализовалось в области интерстициальных теломерных повторов. Возможно, в клетках крыс именно в пределах этих сайтов и инициируется РИНГ [AC2]. Есть и другие свидетельства, что некоторые из интерстициальных теломерных сайтов могут быть «горячими точками» как для спонтанных [AA9, AH10], так и для индуцированных облучением повреждений хромосом [AA4, AB26, AS38, AS39, AS40]. Вывод о дестабилизирующих геном эффектах в рамках внутрихромосомных теломер сделан и в работе [AK17]: когда в геном клеток CHO трансфецировали синтетическую последовательность, соответствующую теломерному повтору позвоночных, частота генных перестроек увеличивалась в 30 раз.

«Против»:

1) Нет связи между структурой/функциями теломер и нестабильностью хромосом.

В [AH7] исследовали две линии эмбриональных фибробластов мышей — дикого типа и мутантных с отсутствием синтеза теломеразы. В ранних пассажах мутантных клеток на многих хромосомах отсутствовали теломеразные концы, чему сопутствовала повышенная радиочувствительность. Но в поздних пассажах частота нестабильности генома в клетках дикого типа повышалась до идентичного и даже большего уровня, чем в клетках без теломеразы, причем в последних — снижалась радиочувствительность (эффекты были обусловлены не теломерами, а тонкими перестройками в белках — регуляторах апоптоза и репарации ДНК).

В [AO2] после изучения РИНГ в клетках форели был сделан вывод, что у позвоночных теломеры никак не связаны со стабильностью хромосом.

2) Теломерные последовательности не являются главной мишенью при инициации РИНГ в клетках человека

В отличие от генома грызунов [AC2, AD6, AK17], в клетках человека интерстициальные теломерные последовательности (локализующиеся в хромосоме 2q31) не являются «горячими точками» ни для спонтанных, ни для радиационно-индуцированных повреждений хромосом [AA11, AD9, AD16]. В противоположность клеткам CHO [AK17], когда в хромосому клеток человека трансфецировали синтетическую последовательность теломеры, то радиационная нестабильность в данном участке хромосомы никак не менялась. Т.е., интерстициальные теломеры как таковые не увеличивают формирование индуцированных облучением перестроек хромосом в клетках человека [AD9].

Различия с эффектами для клеток грызунов (см. выше) могут объясняться, например, тем, что теломеры на трансформированных хромосомах клеток китайского хомячка становятся очень малы по сравнению с теломерами человека [AS36].

Есть, однако, соответствующие данные и для модельной клеточной системы грызунов. При анализе комет (чувствительный метод определения разрывов ДНК) в различных линиях гибридных клеток китайского хомячка и человека (клетки GM10115) было обнаружено, что нет значительных отличий между необлученными (контроль) и нестабильными клонами с индуцированной РИНГ. При этом ни для одного из исследованных 11-ти клонов не было выявлено повышения сверх предсказанной (из стохастических радиационных закономерностей) нестабильности в интерстициальных теломерных повторах [AM34].

Могут возразить, что интерстициальные, внутрихромосомные теломерные последовательности, для которых не показано наличия особо «горячих» радиочувствительных точек, это, де, не совсем то, что полноценные концевые теломеры. Однако не ясно, чем же столь кардинально отличаются вторые от первых; ведь это сходные последовательности нуклеотидов. И если наличие в концевых теломерах «горячих точек» является общебиологическим феноменом, то вряд ли перемещение данных последовательностей внутрь хромосом столь значительно изменяет их устойчивость к излучению. Радиационный фактор — это не экзонуклеаза, которая действует только на концы, но не на внутренние части ДНК.

Интересные данные получены в клинике [AS30]. Был проведен кариотипический и цитогенетический анализ клеток людей, задолго до этого подвергавшихся профессиональному облучению (первая группа) либо радиотерапии (вторая группа). Среди трех людей из первой группы (все возрастом около 80-ти лет) один более 30-ти лет назад получил порядка 10 Гр профессионального облучения. Двенадцать обследуемых из второй группы являлись раковыми больными, накопившими свыше 50 Гр (γ-излучение).

Не было обнаружено нестабильности теломер у престарелых профессионалов в первой группе. И только у трех из семи больных раком простаты и у одного из пяти — с раком груди (т.е., всего у четверых из 12-ти облученных) выявилась более высокая частота теломерного слияния (соединение концов хромосом) вкупе с частой потерей теломер (теломерная РИНГ) [AS30]. Эти данные наводят нас на предположение, что у человека индукция излучением нестабильности теломер может быть связана преимущественно с их исходной спонтанной нестабильностью (при предрасположенности к канцерогенезу или при развитие раков; да и то не всегда), поскольку накопленные дозы излучения в обеих группах, хотя и различны, но крайне, заведомо велики.

Таким образом, данные, полученные в клинике, хотя и на небольших группах, вполне подтверждают вышеприведенные результаты опытов in vitro, согласно которым ситуация с индукцией РИНГ в теломерах клеток человека отнюдь не аналогична таковой в клетках грызунов.

* * *

Все нами рассмотренное применительно к бородатым гипотезам о механизмах РИНГ довольно типично для современных исследований в области молекулярно-клеточной радиобиологии. Несмотря на десяток-полтора лет исследований, окончательные выводы о механизме, связанном как с теломерами, так и с эпигенетической передачей либо с опосредованием РИНГ через свободные радикалы, сделать невозможно. В экспериментальной области применительно к этим механизмам есть и «за», и «против», что вполне нормально для любых фундаментальных молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследований. (Есть, правда, серьезные логические неувязки с существом феномена — ниже). Но наука не стоит на месте; всегда следует ожидать появления новых фактов. Правда, на наш взгляд, если новые факты будут «за», они вряд ли отменят более старые исследования, где было «против»; придется объяснять, почему когда-то было «против».

Поэтому не следует ни ожидать чего-то всеобщего, всеобъемлющего, отвечающего на все вопросы и включающего в себя закономерности для всех биологических объектов. И пока не следует делать каких-то обобщающих, глобальных выводов относительно этих окончательных закономерностей, тем более — прилагать свои выводы к практической деятельности, в частности, в область радиационного нормирования и регламентации эффектов облучения на различные контингенты людей. И не следует включать как бы «сырые» выводы по РИНГ не только в научно-популярную литературу и СМИ, но даже в учебники для ВУЗов, типа «Радиационной биофизики» [РК37]. Фундаментальные, теоретические исследования и соответствующие гипотезы таковыми и должны оставаться до тех пор, пока совокупность полученных результатов не позволит сделать хотя бы более или менее бесспорный и непротиворечивый вывод, т.е., хотя бы построить из гипотезы теорию.

Все это касается и молекулярных механизмов индукции РИНГ, которые исследуют уже, как сказано, порядка полутора десятка лет. И все равно — ничего до конца не ясно.

Вот еще одно предположение о причинах возникновения РИНГ. Согласно Д.М. Спитковскому, в организме существует малая нестабильная субпопуляция клеток. Она названа «клетками эволюционного или/и онтогенетического резерва», в которых нестабильность генома индуцируется путем эпигенетической программы. Считается, что таким образом, де, повышается эволюционное, генетическое разнообразие [РС18].

Дата добавления: 2015-07-20