Робота № 31. Стерилізація насіння та вирощування асептичних рослин

Основні відомості. Основна умова вирощування in vitro рослинних клітин, тканин і органів - це стерильність. У зв’язку з тим, що поверхневі тканини органів рослин інфіковані епіфітними бактеріями, грибами та їхніми спорами, першим кроком для отримання ізольованих клітин, тканин і органів рослин є стерилізація вихідного матеріалу.

Для стерилізації рослинного матеріалу використовують широкий набір різних стерилізуючих речовин. Найпоширенішими є розчини, що містять активний хлор (гіпохлорит кальцію та натрію, хлорамін, “Білизна”), ртутні препарати (сулема, діацид) і окисники (перекис водню, перманганат калію). Іноді використовують препарати азотнокислого срібла – 0,5.2,0 % AgNO3.

Правильний вибір стерилізуючої речовини полягає у тому, щоб нейтралізувати епіфітну мікрофлору і не пошкодити тканини рослин. Крім цього, речовина не повинна глибоко проникати у тканину і має легко вимиватися. Залежно від ступеня забруднення насіння ділять на три групи:

- із незначним зараженням поверхні мікроорганізмами (насіння пшениці, сорго, капусти);

- із зараженням лише зовнішньої поверхні насіння (латук, шпинат, редис, томат, кукурудза, морква);

- з наявністю мікроорганізмів на поверхні і в середині насіння (рис, соняшник, соя, сосна).

Режим обробки насіннєвого матеріалу обирають залежно від того, до якої групи належить насіння. Але стерилізуючу речовину, її концентрацію, а також час стерилізації необхідно визначати для кожного виду та сорту дослідним шляхом.

Мета роботи. Отримати стерильне насіння та виростити з нього асептичні рослини.

Матеріали, реактиви, обладнання. Мильний розчин, 70 %-й розчин спирту, склянки зі стерильною водою, концентрований розчин “Білизни”, склянки для стерилізуючих розчинів, мірний циліндр, насіння сої, пробірки з безгормональним середовищем МС для рослин сої, чашки Петрі зі стерильним фільтрувальним папером, стерильні чашки Петрі, марля, пінцети, скальпелі, спиртівка, спирт для стерилізації інструментів, ламінар-бокс.

Хід роботи.

1. Приготувати розчин “ Білизни” – одна частина препарату і три частини води (1:3).

Примітка. Розчин використовують одноразово відразу після приготування.

2. Промити насінини сої мильним розчином.

3. У марлеві мішечки покласти по 10 насінин.

4. Промиті насінини у боксі на 1 хв. помістити у склянку з 70 %-м етанолом.

5. Стерильним пінцетом перенести мішечки з насінинами у склянки зі стерилізуючим розчином і витримати 15…18 хв.

Примітка. Об’єм насіння має займати 1/4 об’єму стерилізуючого розчину. Мішечки потрібно перевертати кожні 2 хв., аби розчин гарно змочував насіння.

6. Простерилізоване насіння промити у стерильній дистильованій воді. Стерильним пінцетом перенести мішечки із склянки зі стерилізуючим розчином у склянку зі стерильною дистильованою водою. Витримати 10 хв. Промивання повторити тричі, використовуючи нову порцію води.

7. Мішечки з промитим насінням стерильним пінцетом перенести у стерильну чашку Петрі з проавтоклавованими паперовими фільтрами, аби забрати надлишок води.

8. Стерильним пінцетом перенести один із мішечків до іншої чашки Петрі, розгорнути його двома пінцетами і згребти насіння у цю саму чашку.

9. Стерильним пінцетом перенести насіння на безгормональне живильне середовище у пробірки. Відкрити пробірку, обпалити горло пробірки у полум’ї спиртівки, стерильним пінцетом помістити насінину на середовище, знову обпалити горло пробірки і корок в полум’ї спиртівки, після чого закрити пробірку корком.

Підписати пробірку, зазначивши середовище, вид або сорт рослини і дату посадки.

10. Пробірки з насінням помістити у термостат за температури 25 ±1°С.

11. За 4.6 діб перевірити чистоту посіву та схожість насіння. Визначити відсоток асептичного насіння. Результати записати у таблицю

12. Після проростання насіння пробірки перенести у термостат з освітленням 400 лк і температурою 25±1°С.

Таблиця. Визначення оптимальних умов стерилізації насіння

Номер досліду	Концентрація розчину “Білизни”	Тривалість стерилізації, хв	Загальна кількість насіння	Кількість інфікованого насіння за 7 діб	Схожість насіння	Ефективність стерилізації, %
штук	%	штук	%
	1:3
	1:3
	1:3

Контрольні питання

1. Назвіть речовини, які використовують для стерилізації рослинного матеріалу.

2. Які характеристики рослинного матеріалу необхідно враховувати, вибираючи речовину для стерилізації?

3. Назвіть загальні правила стерилізації рослинного матеріалу.

Дата добавления: 2015-07-15