Завдання 1. Провести виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація).

Тема № 6. Обмін речовин і енергії. Дослідження функціонування, регуляції та енергетичної вартості циклу трикарбонових кислот.

Актуальність теми: Вивчення особливостей функціонування циклу трикарбонових кислот є важливим для визначення його ролі у енергозабезпеченні клітини та розуміння його амфіболічної природи. Вміння аналізувати роль ЦТК необхідні для розуміння обміну речовин та енергії у клітині.

Цілі завдання:

Ø Трактувати біохімічні закономірності перебігу обміну речовин: катаболічні, анаболічні, амфіболічні шляхи метаболізму;

Ø Пояснювати біохімічні механізми регуляції процесів анаболізму та катаболізму;

Ø Трактувати біохімічні закономірності функціонування циклу трикарбонових кислот, його анаплеротичні реакції та амфіболічну сутність;

Ø Пояснювати біохімічні механізми регуляції циклу трикарбонових кислот та його ключову роль в обміні речовин та енергії.

Теоретичні питання

1. Загльні закономірності обміну речовин; катаболічні, анаболічні та амфіболічні шляхи метаболізму, їх значення.

2. Екзергонічні та ендергонічні біохімічні реакції; роль АТФ та інших макроергічних фосфатів у їх спряженні.

3. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів та метаболічних шляхів, компартменталізація метаболічних процесів в клітині.

4. Основні стадії катаболізму біомолекул: білків, вуглеводів, ліпідів.

5. Спільні проміжні продукти катаболізму білків, вуглеводів, ліпідів; їх роль в інтеграції метаболізму клітини.

6. Цикл трикарбонових кислот:

· внутрішньоклітинна локалізація ферментів ЦТК;

· послідовність реакцій ЦТК;

· характеристика ферментів та коферментів ЦТК;

· реакції субстратного фосфорилування в ЦТК;

· ферменти та коферменти дегідрогеназних реакцій ЦТК;

· механізм інгібуванням ЦТК фторацетатом та малонатом.

7. Енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот.

8. Анаплеротичні та амфіболічні реакції ЦТК.

Практична робота

Завдання 1. Провести виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація).

Принцип методу. Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях відбуваються реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилування. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, а компоненти дихального ланцюга локалізовані на внутрішній мембрані мітохондрій.

Для виділення мітохондрій м’язову тканину розтирають (гомогенізують) у механічному гомогенізаторі з тефлоновим наконечником, додаючи розчин сахарози. Виділення мітохондрій з гомогенату здійснюють на рефрижераторній центрифузі. Швидкість осадження клітинних компонентів під дією відцентрової сили залежить від їх маси, розміру а також часу центрифугування.

Матеріали та реактиви: свіжі м’язи кроля; розчин № 1 – середовище для виділення мітохондрій (0,25 М розчин сахарози і 0,01 М розчин етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТО – для зв’язування кальцію) з рН = 7,6); розчин № 2 – середовище для отримання суспензії мітохондрій (0,25 М розчин сахарози в 0,02 М розчині трис-буфера з рН = 7,5). Всі розчини охолоджують до + 2^оС.

Хід роботи. Тканину м’язівочищають від жиру, подрібнюють, зважують та гомогенізують в десятикратному об’ємі охолодженого розчину № 1 протягом 40 хв. при швидкості обертання – 600 об/хв. Всі подальші процедури проводять при температурі + 1-2^оС. Гомогенат звільняють від ядер та уламків клітинних мембран шляхом центрифугування впродовж 6 хв. при 700 об/хв. Отриману надосадову рідину (супернатант) переносять в інші центрифужні пробірки та повторно центрифугують протягом 10 хв. при 7000 об/хв.

Після видалення надосадової рідини отримують осад мітохондрій. Для очищення мітохондрій, додають вихідну кількість розчину № 1, осад ресуспензують, а потім проводять повторне осадження мітохондрій протягом 10 хв. при 7000 об/хв. Отриманий осад мітохондрій ресуспензують в невеликому об’ємі розчину № 2, визначають вміст білка та використовують для вивчення функціонування ЦТК, тканинного дихання та окисного фосфорилювання.

Дата добавления: 2015-10-29