Работа 2. Определение эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции по пероксиду водорода

Необходимо провести кинетические измерения с различными начальными концентрациями пероксида водорода при постоянстве концентрации КI. Состав растворов приведен в таблице 3.

Таблица 3. Состав реакционной смеси для проведения кинетических измерений
по определению константы Михаэлиса по H₂O₂.

КI (6×10^–2 М), мл	Ацетатный буфер (pH = 4.6), мл	Пероксидаза, мл	H2O2 (4×10^–3 М), мл
1.5	2.3	0.1	0.1
1.5	2.2	0.1	0.2
1.5	2.1	0.1	0.3
1.5	1.9	0.1	0.5
1.5	1.4	0.1	1.0

Порядок измерений.

Порядок измерений при выполнении данной работы такой же, как при выполнении работы1.

В кювету залейте буферный раствор, растворы йодистого калия и пероксидазы (в соответствии с таблицей 3) и поместите ее в кюветное отделение спектрофотометра (фотоколориметра). Ферментативную реакцию начинают внесением с помощью дозатора необходимого раствора пероксида водорода (см. табл. 3).

Кинетический опыт проводят в течение 5 – 10 минут, затем промойте кювету водой и залейте в нее новые растворы для следующего кинетического опыта. Данные эксперимента запишите в таблицу 2.

Обработка результатов работы 1 и работы 2..

По результатам кинетических измерений постройте кинетические кривые и из линейных участков определите начальные скорости реакции. Пример определения начальных скоростей из линейных участков кинетических кривых приведен на рис. 6.

По заданию преподавателя проведите статистическую обработку на компьютере.

Рис. 5. Кинетические кривые накопления продукта реакции (I₂) при различных начальных концентрациях H₂O₂ (1 – 4). Начальная скорость измеряется как тангенс угла наклона начального участка кривой (область линейности).

Расчет кинетических параметров ферментативной реакции по указанию преподавателя выполните одним из описанных ниже способов.

а) Определение кинетических параметров из графика Лайнуивера–Берка
(график двойных обратных координат).

Для обработки экспериментальных результатов используют линейную форму уравнения Михаэлиса–Ментен (16). Строят график зависимости 1 / r ₀от 1 / [S] и графически определяют константу Михаэлиса и максимальную скорость процесса (см. рис. 4 и 6).

На основании результатов кинетических опытов заполните таблицу 4.

Таблица 4.

№	Объем субстрата, мл	Концентрация субстрата [S], мМ	Начальная скорость v0, мМ/мин	1 / v0, мин/мМ	1 / [S], л/мМ
1.
2.
..

Пример расчета концентрации субстрата

Исходная концентрация йодида калия [KI]₀ = 6×10^–2 М (к работе 1).

Объём рабочего раствора – 4 мл, в нём содержится 1 мл KI (6∙10^-2М). Определяем разбавление: 4 мл: 1 мл = 4. Следовательно, исходный раствор KI разбавили в 4 раза. Определяем концентрацию KI в реакционной смеси: 6×10^–2 М: 4 = 1.5×10^–2 М = 15 мМ.

Исходная концентрация рабочего раствора H₂O₂ = 4×10^–3 М (к работе 2).

Объём –4 мл, в нём 0.1 мл H₂O₂. Определяем разбавление: 4: 0.1 = 40. Следовательно, исходный раствор H₂O₂ разбавили в 40 раз. Находим концентрацию H₂O₂ в реакционной смеси: 4×10^–3: 40 = 1.0×10^–4 М = 0.1 мМ.

Постройте график зависимости 1 /v₀ от 1 / [S], где [S] – концентрация субстрата (H₂O₂ или KI). С помощью графика рассчитайте значения константы Михаэлиса и максимальной скорости процесса по данному субстрату. Пример расчета кинетических параметров ферментативной реакции из опытных данных приведен на рис. 7. Расчет выполнен по пероксиду водорода для двух концентраций второго субстрата – йодида калия.

Рис. 6. Определение параметров уравнения Михаэлиса–Ментен
в координатах уравнения (16).

б) Определение кинетических параметров из графика Лэнгмюра–Хейнса.

Для расчета используют линейную форму уравнения Михаэлиса–Ментен (14). Строят график зависимости [S] / v₀ от [S] и графически определяют K _M и V (см. рис. 2 и рис. 7).

Рис. 7. Определение параметров уравнения Михаэлиса–Ментен
в координатах уравнения (14).

На основании кинетических опытов заполняют табл. 5. Пример расчета концентрации субстрата см. выше в разделе а).

Таблица 5.

№	Объём субстрата, мл	Концентрация субстрата [S], мМ	Начальная скоростьv0, мМ/мин	[S] / v0, мин
1.
2.
…

Постройте график зависимости [S] / v₀ от [S] и определите значения константы Михаэлиса и максимальной скорости. Пример определения K _M и V дан на рис. 7 в координатах координатах уравнения (14). Расчет выполнен по пероксиду водорода для двух разных концентраций KI.

в) Определение кинетических параметров из графика Иди–Хофсти.

Для расчета константы Михаэлиса и максимальной скорости процесса в данном случае используют линейную форму уравнения Михаэлиса–Ментен (15), строят график зависимости v₀ от v₀ / [S] и определяют K _M и V (см. рис. 3 и 8).

По результатам кинетических измерений заполните таблицу 6. Пример расчета концентрации субстрата см. выше в разделе а).

Таблица 6.

№	Объём субстрата, мл	Концентрация субстрата [S], мМ	Начальная скорость v0, мМ/мин	v0 / [S], мин^–1
1.
2.
...

Постройте график зависимости v₀ от v₀ / [S] и определите значения константы Михаэлиса и максимальной скорости. Пример графического определения Kм и V из графика Иди–Хофсти приведен на рис. 8. Расчет выполнен по пероксиду водорода.

Рис. 9. Определение параметров уравнения Михаэлиса–Ментен
в координатах уравнения (15).

Покажите преподавателю значения рассчитанных величин K _M и V.

Расчет параметров уравнения Михаэлиса –Ментен выполните, используя (по указанию преподавателя) один, два или три метода графического расчета.

Дата добавления: 2015-07-10