II. Исследование кинетики пероксидазного окисления йодид-ионов

Цель задачи – изучение кинетики окисления йодида калия пероксидом водорода в присутствии фермента (пероксидазы) и определение эффективных кинетических параметров ферментативной реакции: константы Михаэлиса K_м, максимальной скорости V и константы скорости .

Исследуемая реакция.

Ферментативное окисление йодид-ионов пероксидом водорода осуществляют в кислой среде при pH = 4 – 5, когда вклад неферментативной реакции в суммарный процесс не превышает 1 – 2 %..

Реакция имеет первый порядок по пероксиду водорода в диапазоне концентраций 0.02 – 0.30 мМ. При увеличении концентрации H₂O₂ порядок реакции уменьшается до 0. Порядок реакции по йодид-иону близок к 1 до концентрации 6 мМ.

Характеристика фермента.

Пероксидазы (EC 1.11.1.7) - это большая группа ферментов, катализирующих окисление различных органических молекул в присутствии пероксида водорода и связанных с процессом удаления из живых организмов различных токсичных перекисей. Они присутствуют в растениях, микробах, в тканях животных. Наибольшее распространение получили препараты пероксидазы, выделенные из хрена. Название пероксидаз по ситематической номенклатуре ферментов донор: пероксид водорода оксидоредуктаза. В данном случае донором является I^-.

Препарат фермента представляет собой светло-коричневый аморфный порошок, хорошо растворимый в ацетатном буферном растворе. M_r ≈ 40000. Активность фермента, определенная с использованием разных субстратов, может различаться в несколько раз. Зависит она также от температуры, рН, степени очистки препарата. Пероксидазу применяют в экспериментальной и практической медицине для иммуноферментативного анализа.

Приборы и реактивы.

Исследование кинетики пероксидазного окисления йодид-ионов пероксидом водорода можно проводить с использованием фотоэлектрического концетрационного колориметра или спектрофотометра. Реакцию проводят непосредственно в кювете толщиной 1 см. Изменение концентрации выделившегося йода определяют по поглощению при l = 400 нм.

Растворы пероксидазы и субстратов (йодид калия и пероксид водорода) готовят в 0.1 М ацетатном буфере pH = 4.6.

Концентрация исходных растворов йодида калия составляет 6×10^–2 М и 6×10^–3 М (10 г/л и 1 г/л), а концентрация перекиси водорода – 4×10^–3 М. Рабочие растворы получают путем разбавления исходных буферным раствором.

Ацетатный буферный раствор с pH = 4.6 – 4.7 готовят следующим образом: к 100 мл 1 М раствора уксусной кислоты добавляют 50 мл 1 М раствора едкого натра и доводят до 500 мл дистиллированной водой. Значение рН контролируют с помощью рН метра.

Работа дает возможность выполнить несколько ее вариантов.

1. Определение эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по йодиду калия.

2. Определение эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по пероксиду водорода.

3. Определение истинной константы скорости .

Дата добавления: 2015-07-10