I. Кинетика и механизм пероксидазной реакции

Пероксидаза – фермент окисления пероксидом водорода самых различных органических и неорганических субстратов. Общее стехиометрическое уравнение пероксидазной реакции имеет вид:

.

AH₂ – это полифенолы и многие другие «двухэлектронные» восстановители, A – окисленная (дегидрированная форма AH₂). При окислении «одноэлектронных» восстановителей уравнение пероксидазного окисления имеет такой же вид, как и при окислении йодид-ионов. Формально уравнение можно представить как:

,

хотя реально превращаемой частицей является йодид-ион, а не HI.

Активный центр пероксидазы содержит простетическую группу – гем – сложный железо-порфириновый комплекс и кислотно-основные группы белковой молекулы, участвующие на различных элементарных стадиях сложного процесса.

По современным представлениям пероксидазное окисление «одноэлектронных» восстановителей протекает как бы в три стадии, каждая из которых отвечает обычной схеме Михаэлиса–Ментен.

Окисление йодид-ионов пероксидом водорода в присутствии фермента (пероксидазы) – сложная двусубстратная реакция.

Сначала пероксидаза необратимо окисляется перекоксидом водорода с образованием комплекса Е_I, в котором атом кислорода связан с ионом железа гем-группы:

,

где Е – пероксидаза.

Затем следуют две стадии взаимодействия с йодид-ионом, на каждой из которой происходит передача по одному электрону к окисленному активному центру пероксидазы, к комплексам Е_I и Е_II:

,

,

Фактически из активного центра фермента отщепляется продукт реакции I₂, а не атом. Скорость накопления йода равна:

(1)

Согласно кинетической схеме в системе присутствуют различные формы фермента: Е, Е×Н₂О₂, Е_I, Е_I×I^–, Е_II, Е_II× I^–.

Из условия стационарности для комплексов с учетом уравнения материального баланса для фермента получают кинетическое уравнение накопления йода:

, (2)

где , , , , .

Уравнению (2) можно придать вид уравнения Михаэлиса–Ментен со сложными «эффективными» параметрами r _{max, эфф} и K _{М, эфф}. Для двусубстратной пероксидазной реакции окисления йодид-ионов пероксидом водорода будет два «эффективных» значения для максимальной скорости и два «эффективных» значения для константы Михаэлиса (по I^– и по Н₂О₂).

При постоянной концентрации пероксида водорода, зависимость r _{0, эксп} от концентрации йодид-ионов имеет вид:

, (3)

где

, (4)

. (5)

Для «насыщающих» концентраций (когда скорость реакции не зависит от концентрации субстрата) пероксида водорода , эффективные кинетические параметры приобретают более простой вид:

(6)

(7)

При постоянной концентрации йодид-ионов:

, (8)

где эффективные кинетические параметры определяются соотношениями:

, (9)

. (10)

Зависимость «эффективных» параметров от [I^–] позволяет найти другие кинетические параметры. Так, из графика (рис. 1.а), построенного в координатах уравнения (11)

. (11)

находим и отрезки, отсекаемые на ординате и абсциссе, равные

и .

Из графика (рис. 1.б), построенного в координатах уравнения (12)

, (12)

находим истинную максимальную скорость реакции: .

Рис. 1(а)	Рис. 1(б)

Рис. 1(а, б) Графики, построенные в координатах уравнений (11) и (12).

Аналогичным образом можно проанализировать эффективные кинетические параметры и . Это вновь дает значение , которое можно сравнить с данными, полученными по . Можно также найти .

Запишем уравнение Михаэлиса–Ментен с использованием символов, рекомендованных Международным биохимическим союзом для ферментативной кинетики.

(13)

Здесь v₀ – начальная скорость реакции; V- максимальная скорость; К_м – константа Михаэлиса, т.е. концентрация субстрата, при которой v = V/2. Его можно записать в линейных координатах, удобных для обработки экспериментальных данных:

(14)

(15)

(16)

В первом случае зависимость от [S] графически изображается прямой с наклоном, равным , и отсекаемым на оси ординат отрезком (рис. 2).

Для определения параметров и по уравнениям (15) и (16) экспериментальные данные представляют в координатах ¸ или ¸ (рис. 3 и рис. 4).

Наиболее часто применяют график двойных обратных координат от (график Лайнуивера–Берка), несмотря на то, что это – наименее точный метод определения параметров уравнения Михаэлиса- Ментен.

Рис. 2. График зависимости от [S]	Рис. 3. График зависимости от

Рис. 4. График зависимости от (график Лайнуивера–Берка,
или график двойных обратных координат)

Дата добавления: 2015-07-10