Хроматографические методы очистки биомолекул

Хроматография – это процесс движения хроматографируемого вещества в системе двух фаз, одна из которых перемещается относительно другой. Это перемещение увлекает вещество и обуславливает его миграцию, в ходе которой оно непрерывно перераспределяется между двумя фазами. Скорость миграции зависит от соотношения степеней сродства вещества к подвижной и неподвижной фазам. Если эти соотношения для компонентов исходной смеси неодинаковы, то они мигрируют с разными скоростями и их удается физически разделить друг от друга, после того, как они пройдут достаточный для такого разделения путь.

Теоретические основы хроматографического разделения

Хороший результат хроматографического разделения биомолекул, как и других веществ, можно представить как разрешение двух или более пиков интересующих веществ.

Хроматографическое разрешение определяется как отношение расстояний между максимами двух хроматографических пиков к усредненной ширине этих пиков на уровне базовой линии. Пример приведен на рис. 1. Следует отметить, что объем (время) удерживания пиков и ширина должны быть в одних единицах, чтобы получить безразмерную величину разрешения.

Параметр разрешения является относительной величиной разделенности двух пиков и может быть использован для дальнейшей оптимизации хроматографического процесса, если в этом есть необходимость. Если значение разрешения для двух пиков равно единице (R_S=1 при условии примерного равенства площадей и Гауссовой формы двух пиков), можно ожидать примерно 98% чистоты каждого из разделяемых компонентов (рис. 2). Если необходимо добиться разделения двух компонентов до базовой линии, то значение разрешение должно быть не ниже 1,5 (R_S > 1,5).

Рис. 1. Определение разрешения (R_S) между двумя пиками

Рис. 2. Результаты разделения при различных значениях разрешения

Следует подчеркнуть, что полностью разделенные хроматографические пики не являются эквивалентом чистого вещества. Каждый из пиков может представлять наложение двух и более веществ, которые не разделяются при выбранных условиях проведения хроматографического разделения.

Разрешение, достигаемое при хроматографическом разделении, пропорционально селективности, эффективности и фактору емкости (удерживания). Эти три параметра являются наиболее важными для описания и контроля процесса в колоночной хроматографии. В аналитическом виде разрешение можно представить как:

;

Фактор емкости k является характеристикой удерживания и определяется как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе:

k = m_н / m_п;

Фактор емкости не следует путать с емкостью хроматографической колонки по веществу, выражаемой в мг(ммоль)/мл

Величину k для каждого пика i легко определить по хроматограмме:

;

где V_t – полный объем колонки

В адсорбционной хроматографии, такой как ионообменная или гидрофобная, фактор емкости может быть достаточно большим. Это обусловлено тем, что объем удерживания пика вещества может быть существенно выше объема колонки. В гель-проникающей хроматографии фактор емкости ограничен, поскольку все вещества должны выходить из колонки в объеме (V_t – V₀), где V₀ – мертвый объем колонки.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем ỳже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания т.е. чем ниже размывание пика вещества при его движении по хроматографической колонке. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

;

где - ширина хроматографического пика, измеренная на половине высоты.

Эффективность часто выражают числом теоретических тарелок на 1 метр слоя носителя.

Одним из основных факторов, влияющих на размывание пика, является диффузия молекул разделяемых веществ. Эффект диффузии может быть сведен к минимуму, если расстояния, доступные для диффузии как в подвижной, так и в неподвижной фазах, будут минимальны. На практике это достигается использованием мелкодисперсных носителей состоящих из строго сферических частиц одинакового размера. Для высокоэффективного препаративного выделения биомолекул обычно используют носители с размером гранул 10-15 мкм, при аналитическом разделение применяют более мелкодисперсные носители с размером 3-5 мкм.

Следующим важнейшим фактором является правильная техника эксперимента. Неравномерная набивка носителя в колонку, колоночные адапторы с плохим распределением потока или микропузырьки воздуха из плохо дегазированного элюента приводят к уширению пиков и падению разрешения.

Селективность разделения двух веществ a определяется как способность хроматографической системы разделять пики т.е. как расстояние между двумя пиками. Селективность описывается уравнением:

,

Хорошая селективность является более важным фактором для достижения высокого разрешения, чем эффективность (рис. 3), поскольку R_S прямо пропорционально селективности, но пропорционально корню эффективности. Это означает, что для достижения двукратного увеличения разрешения необходимо повысить эффективность в 4 раза.

Рис. 3. Влияние эффективности и селективности на хроматографическое разрешение

Например, для ионообменной хроматографии селективность зависит не только от природы и количества заряженных групп носителя, но и от условий проведения разделения, таких как рН и ионная сила. Можно просто и воспроизводимо изменять указанные экспериментальные параметры, чтобы предсказуемо менять селективность, достигая, тем самым, очень высокого разрешения при проведении ионообменной хроматографии.

Ионообменная хроматография

Разделение молекул при помощи адсорбционной хроматографии зависит от различных типов взаимодействия между анализируемыми молекулами и лигандами, иммобилизованными на поверхности хроматографической матрицы. Впервые успешное разделение биологических макромолекул было проведено в системе заряженных макромолекул в растворе и противоположно-заряженных компонентов, пришитых на поверхности твердой хроматографической матрицы. На этом принципе основан метод ионообменной хроматографии.

Ионообменная хроматография, пожалуй, наиболее распространенный метод разделения и выделения белков, пептидов, нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. Широкая распространенность метода связана с его высокой разрешающей способностью, применимостью к различным биомолекулам, высокой емкостью сорбентов, а также относительной простотой и воспроизводимостью.

Разделение на ионообменнике происходит за счет обратимой сорбции заряженных макро-молекул образца на привитых ионообменных группах носителя, имеющих противоположный заряд (рис. 4).

Рис. 4. Упрощенная схема взаимодействий в системе ионообменник-биомолекула-противоионы

Большинство процессов разделения на ионообменнике можно разделить на следующие стадии – уравновешивание носителя в стартовых хроматографических условиях, адсорбция молекул образца, начало и конец процесса десорбции и регенерацию носителя.

На первой стадии уравновешивания хроматографический носитель переводят в стартовые условия (рН, состав буфера и ионная сила), которые обеспечивают сорбцию интересующих молекул образца. На этой стадии привитые ионообменные группы носителя насыщаются соответствующими противоионами (напр. простыми катионами или анионами, такими как ионы хлора или натрия).

На второй стадии происходит сорбция образца, во время которой происходит замещение противоионов заряженными молекулами. Несвязавшуюся часть образца вымывают из колонки стартовым буфером (рис. 5, а).

На третьей стадии в состав буфера водятся такие компоненты, которые нарушают взаимодействие между носителем и связавшимся образцом и молекулы образца элюируются из колонки. Для этих целей обычно используют градиентное элюирование возрастающей концентрацией соли или изменение рН. В процессе градиентного элюирования вначале выходят слабосвязавшиеся компоненты, сильно сорбирующиеся компоненты выходят в конце процесса (рис. 5, б).

Четвертая стадия – регенерация – необходима для удаления неэлюированных остатков образца и подготовка носителя для последующих разделений.

А.

Б.

Рис. 5. Нанесение белковой молекулы на катионообменник (а.) и элюирование в градиенте соли (б.)

В ионообменной хроматографии можно применять два метода выделения интересующих макромолекул. Первый заключается в связывании молекул интереса на материале носителя, отделении примесей промывкой и градиентном элюировании связавшихся компонентов. Второй метод, наоборот, заключается в связывании примесей, а выделяемые молекулы, не сорбируясь, проходят через колонку. В большинстве случаев используют первый метод, поскольку он позволяет проводить не только более тонкое фракционирование, но и концентрирование компонентов.

Дата добавления: 2015-10-02