Раствор, содержащий высокомолекулярные компоненты, может быть сконцентрирован при помощи носителя для гель-проникающей хроматографии с мелкими порами. Сухой носитель помещают в раствор, при этом вода и низкомолекулярные компоненты впитываются в разбухающий материал носителя, а высокомолекулярные вещества, не способные проникнуть внутрь гранул носителя, остаются в растворе и могут быть легко отделены центрифугированием или фильтрованием под вакуумом. Обычно фактор концентрирования при использовании такого метода достигает трех, причем рН и ионная сила раствора остаются неизменными. Данный метод концентрирования очень простой быстрый, что делает его особенно привлекательным при работе с лабильными биомолекулами.
Аффинная хроматография
Принцип аффинной хроматографии основан на высокоспецифичном выделении одного из компонентов разделяемой смеси при его взаимодействии с селективным носителем.
При разделении биомолекул специфический отбор происходит на стадии сорбции, поскольку выделяемая молекула обладает специфическим сродством к соответствующему лиганду, закрепленному на поверхности носителя (рис. 13).
Рис. 13. Схематическое изображение процесса специфической сорбции белков на аффинном сорбенте. Лиганд L специфически связывается с белком Е, а белки Р и Х, не связываясь, проходят через колонку с фронтом элюента.
В качестве аффинных лигандов могут выступать вещества с высокой избирательностью к тому или иному белку. В случае ферментов, к ним можно отнести специфические субстраты, ингибиторы или кофакторы, привитые на поверхность хроматографического носителя. В некоторых случаях аффинными сорбентами могут выступать нерастворимые субстраты, такие как целлюлоза для целлюлаз или крахмал для амилаз.
В настоящее время производится множество различных аффинных сорбентов. В большинстве случаев, лиганды, привитые на поверхность носителя, обладают специфичностью не к одному какому-либо белку, а к определенной группе. В некоторых случаях, особенно когда фермент имеет специфический субстрат, используемый в качестве привитого лиганда, удается получить фермент 1000-кратной очистки после всего одной стадии выделения. К сожалению, такие случаи встречаются нечасто. Основная проблема заключается в неспецифической сорбции мешающих белков, трудоемкости процесса подбора идеальных условий для разделения, а также относительно низкой емкости аффинных сорбентов.
Дата добавления: 2015-10-02; просмотров: 59 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Обессоливание | | | Иммуноаффинная хроматография |