Механизм хроматофокусирования

При ионообменной хроматографии градиент рН обычно создается в смесителе градиента. Для нисходящего градиента смесительная камера заполняется стартовым буфером с высоким значением рН, а другая камера содержит лимитирующий буфер с более низким значением рН. По мере вытекания буфера, все большее количество лимитирующего буфера с низким рН попадает в смесительную камеру и затем на колонку, таким образом, рН элюента постепенно снижается. Однако, при таком подходе, бывает непросто добиться создания линейного градиента рН, поскольку буферная емкость стартового и лимитирующего буфера должны быть одинаковы в выбранном диапазоне рН. Кроме того, сам ионообменник обладает собственной буферной емкостью и это тоже необходимо учитывать (рис. 9а).

Хроматофокусирование использует буферный эффект заряженных групп самого ионообменника, и градиент рН формируется автоматически, по мере того, как элюирующий буфер проходит через слой ионообменника. Для создания нисходящего градиента стартовый рН колонки выше, чем рН элюирующего буфера, а поскольку ионообменник должен содержать щелочные группы, выбирают анионообменник (рис. 9б).

Рис. 9. Принципиальная схема создания градиента рН в ионообменной хроматографии и при хроматофокусировании.

Вначале колонку эквилибруют щелочным буфером, а элюент (полибуфер) доводят до более низкого значения рН. Полибуфер содержит большое количество разнообразных заряженных групп и его буферная емкость равна буферной емкости ионообменника в широком диапазоне рН. По мере прохождения полибуфера через колонку, его кислые компоненты связываются со щелочными группами ионообменника, и рН постепенно понижается по длине колонки, образуя плавный градиент от начала колонки к ее концу. В конце элюирование, вся колонка оказывается эквилиброванной буфером с рН близким к рН полибуфера.

Если на колонку был нанесен образец, содержащий смесь белков, то они распределятся по колонке в соответствии с рН и изоэлектрическими точками. Белок будет двигаться до тех пор, пока не достигнет точки, где рН будет равно его pI, после чего, вплоть до элюции, его движение резко замедлится. Молекула останется связанной до тех пор, пока рН формирующего градиента не станет ниже pI белка. Тогда белок начнет опять продвигаться с элюирующем буфером до тех пор, пока рН не станет выше pI, и белок вновь свяжется с ионообменником. Этот процесс будет повторяться до тех пор, пока белок не выйдет из колонки в соответствии с его изоэлектрической точкой.

Если после того, как белки распределились по колонке в соответствии с изоэлектрическими точками, нанести вторую порцию таких же белков, то они будут мигрировать с такой же скоростью, как и элюент, пока не встретят медленно мигрирующий первый образец. Затем оба образца будут продвигаться вместе к выходу из колонки и будут элюированы одновременно. Этот эффект получил название фокусирующего.

Сочетание высокого разрешения и фокусирующего эффекта делают хроматофокусирование одним из наиболее мощных методов разделения в биохимии.

Гель-проникающая хроматография

Гель-проникающая хроматография (ГПХ) или гель-фильтрация является еще одним часто используемым методом при разделении биомолекул. Разделение происходит в порах носителя, причем, в отличие от других видов хроматографии, не происходит взаимодействия между материалом носителя и разделяемым веществом. Молекулы, чей размер крупнее самых больших пор хроматографического носителя, не проникают внутрь гранул и мигрируют с потоком элюента. Таким образом, они выходят в первую очередь (рис. 10).

Более мелкие молекулы имеют возможность проникать в поры носителя и задерживаться там, причем, чем мельче молекулы, тем более продолжительное время они могут находиться в порах сорбента и, соответственно, элюируются позже других.

Рис. 10. Схема разделения белков гель-фильтрацией.

Таким образом, происходит разделение молекул по их геометрическим размерам, начиная с самых крупных и заканчивая самыми маленькими.

Чем больше путь проходит разделяемый образец по колонке, тем более высокое разрешение можно получить. Поэтому, колонки для гель-фильтрации, в отличие от ионообменных колонок, делают длинными и тонкими.

Другим важным фактором, влияющим на разрешение при проведении гель-фильтрации, является объем наносимого образца. Чем он меньше, тем выше разрешение. При аналитическом разделении, когда разрешение является важнейшим фактором, объем образца (и, как следствие, ширина стартовой зоны) должны быть минимальными.

Обычно, при аналитическом разделении смеси биомолекул, объем образца не должен превышать 1,5-2% от объема колонки для ГПХ.

При проведении препаративного разделения, когда необходимо получить максимальное количество интересующего вещества, а также при обессоливании белкового образца, когда разница в массах разделяемых молекул составляет десятки или сотни раз, допустима более высокая загрузка колонки. В этом случае, объем образца должен быть максимальным, чтобы достичь желаемого разделения. На рис. 11 представлены виды хроматограмм при различном объеме загрузки образца.

	А280

Объем элюента

Рис. 11. Хроматографические профили при различных объемах загружаемого образца
1). Объем образца очень мал, по сравнению с объемом колонки, аналитический вариант. 2). Максимальный объем образца, при котором происходит отделение хотя бы одного компонента смеси (в данном случае компонента А, зоны В и С перекрываются).
3). Максимальный объем образца, при котором происходит полное разделение всех трех компонентов.

Существует достаточно широкий спектр типов носителей для гель-проникающей хроматографии, которые используются для разделения смесей различного состава. Каждые из них характеризуется различными механическими, химическими свойствами, а также способностью разделять молекулы в определенном диапазоне молекулярных масс. Если анализируемые молекулы имеют массу, бόльшую, чем верхний предел эксклюзии для данного носителя, то они не будут задерживаться и полностью выйдут из колонки вместе с фронтом элюента. Молекулы, имеющие массу равную или меньше нижнего предела эксклюзии, элюируются, обычно, в объеме примерно равном полному объему хроматографической колонки. Свойства носителей типа Sephadex, широко применяемых при гель-проникающей хроматографии белков, приведены в табл. 2.

Табл. 2. Диапазон фракционирования для глобулярных белков и пептидов носителей типа Sephadex

Типа носителя	Диапазон фракционирования, Да	Степень набухания сухого геля в воде, мл/г
Sephadex G-10	- 700	2 – 3
Sephadex G-15	- 1500	2,5 – 3,5
Sephadex G-25	1000 – 5000	4 – 6
Sephadex G-50	1500 – 30000	9 – 11
Sephadex G-75	3000 – 70000	12 – 15
Sephadex G-100	4000 – 150000	15 – 20
Sephadex G-150	5000 – 400000	20 – 30
Sephadex G-200	5000 – 800000	30 – 40

Для эффективного разделения веществ при помощи гель-фильтрации необходимо пользоваться следующими правилами:

- носитель должен иметь диапазон фракционирования, охватывающий все интересующие разделяемые вещества и не должен быть значительно шире. Напр. не следует использовать носитель с диапазоном фракционирования 10³-2*10⁶ при разделении двух белков с массами 10 и 25 кДа или для обессоливания образца.

- материал носителя не должен взаимодействовать с разделяемыми веществами, в противном случае невозможно будет добиться разделения строго по геометрическим размерам молекул. Практически любой носитель для гель-фильтрации может неспецифически взаимодействовать с некоторыми типами молекул. Так, широко распространенные носители Sephadex на основе поперечносшитых декстранов, взаимодействуют с ароматическими молекулами, то приводит к их удерживанию в колонке, а носители на основе силикагелевой матрицы задерживают заряженные молекулы разделяемых веществ из-за электростатического взаимодействия. Эти эффекты, в значительной степени, можно скорректировать при использовании соответствующих элюентов, ослабляющих гидрофобные или электростатические взаимодействия.

- используемый элюент не должен оказывать значительного воздействия на разделяемые молекулы и материал носителя. Использование сильных кислот в составе элюентов совместно с носителями на основе сшитых полисахаридных матриц может привести к частичному гидролизу гликозидных связей, а даже слабощелочные (рН выше 7,5) условия приводят к быстрому разрушению силикагелевых матриц. Органические компоненты элюента способны приводить к существенным конформационным изменениям разделяемых молекул, и, как следствие, непредсказуемому порядку их выхода из хроматографической колонки.

- эффективность разделения возрастает при использовании носителей с более мелкими зернами. Однако при переходе от крупнозернистого к мелкозернистому носителю значительно повышается противодавление, поэтому применение колонок с мелкозернистым носителем на обычных хроматографических системах низкого давления представляется затруднительным. Использование высокоэффективной хроматографии высокого давления приводит к значительному повышению (иногда в десятки раз) затрат на разделение белков. Следует отметить, что чем ближе форма частиц носителя к сферической и чем ýже распределение этих частиц по размерам – тем меньше создаваемое носителем противодавление. Поэтому использование сферических мелкодисперсных носителей с узким распределением частиц по размерам является предпочтительным.

Дата добавления: 2015-10-02