Постановка реакции.

На специальном предметном стекле готовят мазок из иссле­дуемого материала, обрабатывают иммунной кроличьей сыво­роткой, стёкла помещают во влажную камеру, инкубируют в те­чение 15 мин. при температуре 37 С, промывают препарат и на­носят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против иммуноглобулинов кролика, инкубируют в термостате и промы­вают препарат.

Метод иммунофлюоресценции используется в лабораторной диагностике для обнаружения специфических антинуклеарных антител, характеристики их расположения; определения популя­ций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток.

Иммунофлюоресцентные методы широко используются для обнаружения аутоантител и антител к тканевым и клеточным ан­тигенам. Используя срезы тканей (содержащих большое число антигенов), на одном предметном стекле можно выявить антите­ла к нескольким разным антигенам, установив при этом их внут­ритканевое (клеточное) или внутриклеточное распределение.

РИФ основана на соединении антигенов бактерий, риккетсий и вирусов со специфиче­скими антителами, меченными флюоресцирующими красителями (флуоресцеинизотиоцианат, родамин, В-изотицианит, лиссатинродамин В-200, сульфохлорид и др.), имеющими реакцион­но-способные группы (сульфохлорид, изотиоцианит и др.). Эти группы соединяются со сво­бодными аминогруппами молекул антител, которые не теряют при обработке флуорохромом специфического сродства к соответствующему антигену. Образовавшиеся комплексы АГ-АТ становятся хорошо видимыми, ярко светящимися структурами под люминесцентным микро­скопом (рис 48). С помощью РИФ можно обнаруживать небольшие количества бактериаль­ных и вирусных антигенов. Метод РИФ используют в двух вариантах: прямой и непрямой ме­тод.

Прямой метод основан на непосредственном соединении антигена с меченым антите­лом. Непрямой метод - на поэтапном выявлении комплекса АГ-АТ с помощью флуоресцент­ных красителей. Первый этап заключается в образовании иммунных комплексов определенно­го антигена со специфическими антителами. Второй этап - в выявлении этого комплекса пу­тем обработки его меченым антигаммаглобулином.

Преимущество РИФ - простота, высокая чувствительность, скорость получения результата. РИФ применяется как метод ранней экспресс-диагностики гриппа, дизентерии, малярии, чумы, туляремии, сифилиса и др. Для проведения такого исследования используется люминесцентный микроскоп.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД (ИФМ)

Метод разработан в 70-х годах шведскими учёными Энгвал-лом и Перлманном, голландскими учёными Ван Вееменом и Шууром и американскими исследователями под руководством Рубинстайна.

Метод широко используются в лабораторной клинической иммунологии для диагностики инфекционной патологии, вклю­чая ВИЧ-инфекцию, дефектов гуморального и клеточного звень­ев иммунной системы, в аутоиммунной патологии и в массовых эпидемиологических исследованиях.

В силу чрезвычайно мощной каталитической активности ферменты наиболее чувствительны и универсальны в качестве метки. В качестве ферментов-маркеров используются щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза, бетта-галактозидаза, пероксида-за хрена и т.д. Каталитическая активность ферментов различна и зависит от его конформационных свойств. Большинство исполь­зуемых ферментов за 1 мин. при обычной температуре способны превращать в компоненты 10 молекул субстрата в расчете на од­ну молекулу фермента.

Иммунопероксидазные методы наиболее просты и эффек­тивны при анализе срезов тканей, обнаружении антигенов после электрофоретического разделения. Введение в систему МкАт по­вышает специфичность ИФА.

Существует множество модификаций метода ИФА, но наи­более известным и используемым в практике является гетеро­генный ИФА. В качестве «твердой фазы» используют полисти­рол, полиэтилен, сефадекс, акриламид, целлюлозу, бумажный диск и др.

Дата добавления: 2015-09-05