Глава 4. Применение ЯМР в фармацевтическом анализе.

Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР для проведения качественного и количественного анализа. Применение ЯМР-спектроскопии в количественном анализе основано на прямой пропорциональности молярной концентрации магнитно-активных ядер интегральной интенсивности соответствующего сигнала поглощения в спектре.

1.Установление подлинности действующего вещества (ДВ).

Установление подлинности ДВ осуществляют путем сравнения спектра испытуемого образца со спектром стандартного образца или с опубликованным стандартным спектром. Спектры стандартных и испытуемых образцов должны быть получены с использованием тех же самых методик и условий. Пики в двух спектрах должны совпадать по положению (отклонения значений δ испытуемого и стандартных образцов в пределах ±0,1 м.д. для ЯМР ¹Н и ±0,5 м.д. для ЯМР ¹³С, интегральной интенсивности и мультиплетности, значения которых следует приводить при описании спектров. При отсутствии стандартного образца можно использовать рабочий стандартный образец, идентичность которого подтверждают самостоятельной структурной интерпретацией спектральных данных и альтернативными методами.

При подтверждении подлинности образцов нестехеометрического строения (например, природных полимеров переменного состава) допускают несовпадение пиков испытуемого и стандартных образцов по положению и интегральной интенсивности сигналов. Сравниваемые спектры должны быть подобны, т.е. содержать одинаковые характеристические области сигналов, подтверждающие совпадение фрагментного состава испытуемого и стандартных образцов.

Для установления подлинности смеси веществ (экстрактов) допускают использование одномерных спектров ЯМР целиком, как «отпечатков пальца» объекта, без детализации значений δ и мультиплетности отдельных сигналов. В случае использования двумерной ЯМР-спектроскопии при описании спектров (фрагментов спектра), заявленных на подлинность, следует приводить значения кросс-пиков.

2.Идентификация посторонних примесей/остаточных органических растворителей.

Идентификацию посторонних примесей (остаточных органических растворителей) осуществляют аналогично установлению подлинности ЛВ, ужесточая требования к чувствительности и цифровому разрешению. При установлении строения примесного соединения, не указанного в фармакопейной статье, проводят самостоятельную интерпретацию спектральных данных. В этом случае структура примесного соединения должна быть подтверждена альтернативными методами. При перекрывании сигналов10 примесного соединения с сигналами ЛВ в спектре испытуемого образца используют следующие приемы: смена растворителя; изменение температуры регистрации спектра; преобразование лоуренсовой формы линии в гауссову и т.п.

3.Определение содержания посторонних примесей (остаточных органических растворителей) относительно ЛВ.

Метод ЯМР является абсолютным методом определения мольного соотношения ЛВ и примесного соединения (n_лв/n_{примесь}):

где S'_лв и S'_{примесь} – нормированные значения интегральных интенсивностей ЛВ и примеси. Нормировку проводят по числу ядер в структурном фрагменте, обуславливающих измеряемый сигнал. Стандартная неопределенность количественного измерения мольного соотношения ЛВ и примеси определяется стандартной неопределенностью количественного измерения отношения интегральных интенсивностей сигналов компонентов смеси.

Массовую долю примеси (остаточного органического растворителя) относительно ЛВ (X_пр) определяют по формуле:

где: M_пр – молекулярная масса примеси; M_ст – молекулярная масса ЛВ; S'_пр – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала примеси; S'_лв – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала ЛВ.

4. Количественное определение содержания вещества (ЛВ, примеси, остаточного растворителя) в фармацевтической субстанции.

Абсолютное содержание вещества в фармацевтической субстанции определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов определяемого вещества, не перекрываясь с ними. Интенсивности сигналов опредяляемого вещества и стандарта не должны существенно различаться. При выборе вещества-стандарта следует отдавать предпочтение не гигроскопичному, не образующему кристаллосольватов веществу.

Процентное абсолютное содержание определяемого вещества в испытуемом образце в пересчете на абсолютно сухое вещество (X %масс) вычисляют по формуле:

где: S' – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала; M_а – молекулярная масса определяемого вещества; M_ст – молекулярная масса стандарта; m_а – навеска испытуемого образца; m_ст - навеска вещества-стандарта; W – содержание влаги, в процентах.

В качестве веществ-стандартов можно использовать следующие вещества: малеиновая кислота (2H; 6,60 м.д., M = 116,07), бензилбензоат (2H; 5,30 м.д., M = 212,25), малоновая кислота (2H; 3,30 м.д., M = 104,03), сукцинимид (4H; 2,77 м.д., M = 99,09), ацетанилид (3H; 2,12 м.д., M = 135,16), трет-бутанол (9H; 1,30 м.д., M = 74,12).

Относительное содержание вещества в фармацевтической субстанции определяется методом внутренней нормализации, как доля компонента в смеси компонентов. Мольная (X_моль) и массовая (X_масс) доля компонента i в смеси n веществ определяется по формулам:

Методика определения относительного содержания вещества в фармацевтической субстанции должна быть валидирована в отношении отсутствия наложения соответствующих сигналов.

5. Определение молекулярной массы белков и полимеров.

Молекулярные массы белков и полимеров определяют сравнением их подвижности с подвижностью соединений-стандартов с известной молекулярной массой, используя методики DOSY. Измеряют коэффициенты самодиффузии (D) испытуемых и стандартных образцов, строят график зависимости логарифмов молекулярных масс соединений-стандартов от логарифмов D. По полученному таким образом графику методом линейной регрессии определяют неизвестные молекулярные массы испытуемых образцов. Полное описание DOSY - испытания приводится в фармакопейной статье.

Список использованной литературы.

1. Пентин Ю. А., Вилков Л. В. Физические методы исследования в химии. - М.: Мир, ООО «Издательство АСТ», 2003. - 683 с., ил. - (Методы в химии).

2. Жарский И. М., Новиков Г. И. Физические методы исследования в неорганической химии: Учеб. Пособие для хим. и хим.-технол. вузов. - М.: Высш. шк., 1988. - 271 с., ил.

3. Сликтер. Ч. Основы теории магнитного резонанса. - М.: Мир, 1981. - 448 с., ил.

4. Гюнтер Х. Введение в курс спектроскопии ЯМР: Пер. с англ. - М.: Мир, 1984 — 478 с., ил.

5. Хауссер К. Х., Кальбитцер Х. Р. ЯМР в медицине и биологии: структура молекул, томография, спектроскопия in-vivo: Пер. с нем. под ред. Рябченко С. М. с предисл. Рябченко С. М., Рожковской З. З. - Киев: Наукова думка, 1993 — 259 с.

6. Ионин Б. И., Ершов Б. А., Кольцов А. И. ЯМР-спектроскопия в органической химии/Под ред. Ершова Б. А. - 2-е изд., перераб. - Л.: Химия, 1983. - 272 с., ил.

7. Бельская Н. П., Ельцов О. С., Понизовский М. Г. Ядерный магнитный резонанс. Теория и практика. Часть I. Учебное пособие по курсам «Учебно- исследовательская работа студентов», «Основы научных исследований» и «Химическая технология органических красителей», «Спектроскопия ЯМР». - Екатеринбург: Изд-во УрФУ, 2010. - 105 с.

8. В. Польшаков. 7 фактов о возможностях метода ЯМР в изучении биомолекул // ПостНаука [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://postnauka.ru/faq/16225.

9. Устынюк Ю.А. Лекции по спектроскопии ядерного магнитного резонанса- Режим доступа:

http://www.chem.msu.su/rus/teaching/ustyniuk-nmr-lectures/Lecture-2.pdf

10.

Дата добавления: 2015-11-14