Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие редактора.......................................................................................... 9

Предисловие автора................................................................................................ 12

ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ...................................... 17

ВВЕДЕНИЕ 18

Глава 1. ГЕНОМ............................................................................................................ 25

1.1. Гены и хромосомы................................................................................... 28

1.2. Геном прокариот....................................................................................... 30

1.2.1. Геном вирусов.............................................................................................. 31

1.2.2. Нуклеоид бактериальной клетки............................................................. 32

1.2.3. Геном архебактерий................................................................................... 34

1.2.4. Минимальный размер генома одноклеточных организмов............. 36

1.3. Геном эукариот.......................................................................................... 39

1.3.1. Последовательности нуклеотидов эукариотического генома......... 40

1.3.2. Хроматин....................................................................................................... 44

1.3.3. Роль ДНК-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина.............................................................................................. 55

Глава 2. РЕАЛИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ ПРИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.......................................................................................................................... 59

2.1. Транскрипция............................................................................................. 60

2.1.1. ДНК-зависимые РНК-полимеразы.......................................................... 61

2.1.2. Единицы транскрипции (транскриптоны)............................................. 70

2.1.3. Этапы транскрипции.................................................................................. 77

2.1.4. Хроматин во время транскрипции....................................................... 107

2.2. Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации РНК 119

2.2.1. Процессинг РНК у бактерий................................................................... 120

2.2.2. Редактирование пре-мРНК.................................................................... 126

2.2.3. Другие модификации эукариотических мРНК.................................. 136

2.2.4. Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов РНК-полимеразы II........................ 152

2.3. Функциональная компартментализация ядра............................ 156

2.3.1. Интерфазные хромосомы в ядре.......................................................... 157

2.3.2. Ядрышко...................................................................................................... 160

2.3.3. Пространственная организация синтеза мРНК................................ 162

2.3.4. Ядерные тельца и домены..................................................................... 165

2.3.5. Компартментализованное ядро............................................................ 167

2.4. Биосинтез белка рибосомами бактерий........................................ 168

2.4.1. Рибосомы.................................................................................................... 169

2.4.2. Этапы биосинтеза белка......................................................................... 174

2.4.3. Антибиотики, действующие на уровне трансляции........................ 183

2.5. Трансляция у эукариот......................................................................... 185

2.5.1. Особенности первичной структуры эукариотических мРНК......... 186

2.5.2. Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами... 187

2.5.3. Элонгация полипептидных цепей........................................................ 196

2.5.4. Терминация трансляции......................................................................... 198

2.5.5. Трансляция в митохондриях.................................................................. 200

2.5.6. Трансляция в хлоропластах................................................................... 204

Глава 3. ОСНОВНЫЕ ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ............ 208

3.1. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот 210

3.1.1. Регуляция на уровне инициации транскрипции.............................. 210

3.1.2. Регуляция синтеза РНК на уровне элонгации и терминации....... 214

3.2. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот 223

3.2.1. Передача сигнала и вторичные мессенджеры................................. 226

3.2.2. Механизмы позитивной регуляции транскрипции.......................... 243

3.2.3. Механизмы негативной регуляции транскрипции........................... 281

3.2.4. Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов 288

3.2.5. Импринтинг................................................................................................. 300

3.2.6. Метилирование ДНК в регуляции транскрипции............................. 301

3.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов............. 312

3.3.1. Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРНК..................................................................................................... 312

3.3.2. Сплайсинг РНК в регуляции экспрессии генов................................ 325

3.3.3. Избирательная деградация мРНК........................................................ 333

3.4. Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции................ 337

3.4.1. Регуляция инициации трансляции...................................................... 337

3.4.2. Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей.................... 346

3.4.3. Регуляция терминации трансляции.................................................... 348

3.5. Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина............. 349

3.6. Посттрансляционная регуляция экспрессии генов.................. 351

3.6.1. Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей 352

3.6.2. Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков 354

3.6.3. Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков................................................................................................................ 355

3.6.4. Сплайсинг белков..................................................................................... 359

3.6.5. Другие посттрансляционные модификации белков........................ 362

Глава 4. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ........... 365

4.1. Репликация ДНК...................................................................................... 365

4.1.1. Белки, участвующие в репликации ДНК............................................. 366

4.1.2. Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4.............................. 369

4.1.3. Особенности функционирования репликативной вилки эукариот 374

4.2. Регуляция репликации ДНК................................................................ 377

4.2.1. Инициация репликации ДНК у E. coli и ее регуляция..................... 379

4.2.2. Регуляция репликации плазмиды ColE1............................................ 386

4.3. Особенности репликации линейных геномов............................ 392

4.3.1. Линейные хромосомы бактерий........................................................... 392

4.3.2. Репликаторы эукариот............................................................................. 395

4.3.3. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом... 397

4.3.4. Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот.............. 398

Глава 5. ЗАЩИТА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ.................................... 401

5.1. Мутации...................................................................................................... 402

5.1.1. Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности................................................................................................................ 404

5.1.2. SOS-мутагенез у бактерий...................................................................... 419

5.1.3. Мутаторный фенотип............................................................................... 423

5.1.4. Экспансия ДНК.......................................................................................... 425

5.1.5. Адаптивные мутации............................................................................... 428

5.1.6. Механизмы защиты генома от мутаций.............................................. 432

5.2. Репарация ДНК......................................................................................... 433

5.2.1. Основные механизмы репарации поврежденной ДНК.................. 434

5.2.2. Эксцизионная репарация в клетках животных................................. 435

5.2.3. Гомологичная рекомбинация в репарации ДНК.............................. 446

5.2.4. Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов................................ 448

5.2.5. Полимераза поли(ADP-рибозы) в репарации ДНК у эукариот..... 450

5.3. Альтруистичная ДНК............................................................................. 453

5.3.1. Парадокс возможности существования многоклеточных организмов 455

5.3.2. Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями.................................................................... 458

5.3.3. Селективная защита генов от мутаций............................................... 462

5.3.4. Высокоупорядоченое расположение летальных генов на хромосомах 469

5.3.5. Возможный смысл парадокса С............................................................ 477

Глава 6. СОВРЕМЕННАЯ КОНЦЕПЦИЯ ГЕНА................................................ 483

ЧАСТЬ II. ИСКУССТВЕННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ 492

Глава 7. ПРИНЦИПЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ................................................. 493

7.1. Основные ферменты, используемые в генной инженерии.. 500

7.1.1. Рестриктазы и ДНК-метилазы............................................................... 500

7.1.2. ДНК- и РНК-лигазы................................................................................... 508

7.1.3. Ферменты матричного синтеза ДНК и РНК........................................ 509

7.1.4. Другие ферменты...................................................................................... 515

7.2. Векторы...................................................................................................... 517

7.2.1. Плазмидные векторы............................................................................... 518

7.2.2. Векторы на основе фага l...................................................................... 521

7.2.3. Космиды и фазмиды................................................................................ 524

7.2.4. Сверхъемкие векторы YAC, BAC и PAC............................................ 526

7.2.5. Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы......................... 529

7.2.6. Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование 531

7.2.7. Векторы для переноса ДНК в клетки животных и растений.......... 547

7.3. Клонотеки генов...................................................................................... 549

7.3.1. Получение клонотек генов...................................................................... 549

7.3.2. Введение рекомбинантных ДНК в клетки........................................... 552

7.3.3. Методы скрининга клонотек генов........................................................ 554

7.4. Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток........................................................................... 556

7.4.1. Клетки яичников китайских хомячков (линия CHO)........................ 557

7.4.2. Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0).......................................... 559

7.4.3. Клетки селезенки мышей (линия MEL)............................................... 560

7.4.4. Клетки африканской зеленой мартышки (линия COS)................... 562

7.4.5. Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами............................ 563

7.4.6. Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии. 564

7.5. Бесклеточные белоксинтезирующие системы........................... 565

7.5.1. Прокариотические системы................................................................... 567

7.5.2. Эукариотические системы..................................................................... 570

7.5.3. Проточные системы................................................................................. 571

7.6. Другие современные методы исследования генов.................. 573

7.6.1. Рестрикционное картирование генов................................................. 573

7.6.2. "Прогулки и прыжки по хромосомам".................................................. 574

7.6.3. S1-картирование РНК и ДНК................................................................. 575

7.6.4. Футпринтинг................................................................................................ 576

7.7. Стратегия выделения нового гена.................................................. 577

Глава 8. НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ... 580

8.1. Методы направленного получения мутаций............................... 581

8.1.1. Получение делеций и вставок............................................................... 581

8.1.2. Химический мутагенез............................................................................ 583

8.1.3. Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов 585

8.1.4. Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе....... 592

8.2. Белковая инженерия............................................................................. 594

8.2.1. Библиотеки пептидов и эпитопов........................................................ 595

8.2.2. Белки-репортеры в гибридных белках................................................ 602

8.2.3. Гибридные токсины.................................................................................. 603

8.2.4. Подходы к созданию новых ферментов.............................................. 607

8.2.5. Субтилигаза в лигировании пептидов................................................ 612

8.3. Концепция ксенобиоза......................................................................... 615

Глава 9. АНТИСМЫСЛОВЫЕ РНК, РИБОЗИМЫ И ДЕЗОКСИРИБОЗИМЫ 623

9.1. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды.................................... 623

9.1.1. Механизм действия антисмысловых РНК.......................................... 624

9.1.2. Использование антисмысловых РНК.................................................. 626

9.1.3. Природные антисмысловые РНК......................................................... 631

9.1.4. Антисмысловые РНК и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций...................................................................... 634

9.2. Рибозимы и дезоксирибозимы......................................................... 636

9.2.1. Типы рибозимов........................................................................................ 636

9.2.2. Свойства рибозимов................................................................................ 638

9.2.3. Рибозимы как лекарственные средства............................................. 642

9.2.4. Репарация мутантных РНК с помощью рибозимов, осуществляющих транс- сплайсинг............................................................................................. 647

9.2.5. Дезоксирибозимы..................................................................................... 649

9.3. Аптамеры................................................................................................... 651

9.4. Молекулы РНК у истоков жизни........................................................ 654

9.4.1. Молекулы РНК в качестве РНК-репликаз........................................... 655

9.4.2. Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами РНК... 658

Глава 10. ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ.................................. 663

10.1. Способы получения трансгенных многоклеточных организмов 663

10.2. Экспрессия трансгенов........................................................................ 666

10.3. Использование трансгенов у животных....................................... 667

10.3.1. Исследование механизмов экспрессии генов.............................. 668

10.3.2. Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе........................................................................................... 669

10.3.3. Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных............................................................................................. 670

10.3.4. Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека................................................................................................................ 673

10.4. Трансгенные растения......................................................................... 675

10.5. Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний 677

10.5.1. Способы доставки новых генов в геном человека....................... 678

10.5.2. Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях......... 684

10.5.3. Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний 686

10.5.4. Ближайшие перспективы использования генотерапии............. 690

10.5.5. Успехи генотерапии в модельных экспериментах....................... 692

10.5.6. Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии................................................................................................................ 693

Глава 11. ДНК-ДИАГНОСТИКА И ДНК-ТИПИРОВАНИЕ................................. 695

11.1. ДНК-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний 697

11.1.1. Получение клинического генетического материала.................... 697

11.1.2. Диагностика заболеваний.................................................................. 699

11.2. ДНК-типирование.................................................................................... 710

11.2.1. ДНК-типирование микроорганизмов............................................... 711

11.2.2. Идентификация личности на основе минисателлитной ДНК: определение отцовства............................................................................................. 713

11.3. Микроматрицы и микрочипы ДНК.................................................... 720

11.3.1. Методы создания микроматриц ДНК............................................... 721

11.3.2. Ограничения в использовании микроматриц ДНК...................... 723

11.3.3. Использование микроматриц ДНК в фундаментальных и прикладных исследованиях................................................................................... 725

Глава 12. КАРТИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА................................................................................................. 729

12.1. Основные подходы к картированию генома человека........... 729

12.1.1. Генетические карты сцепления......................................................... 730

12.1.2. ПЦР в исследованиях генома человека......................................... 735

12.1.3. Физические карты низкого разрешения.......................................... 737

12.1.4. Физические карты высокого разрешения....................................... 739

12.2. Определение полной первичной структуры ДНК генома человека 740

12.3. Базы данных получаемой информации........................................ 741

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................... 744

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.......................................................................... 749

Предисловие редактора

Сей факт с сияющим лицом

Вношу как ценный вклад в науку.

Саша Черный

Науку двигают методы и увенчивают теории. Концептуальные прорывы 1950–1960-х годов – прежде всего, двойная спираль, генетический код и механизм биосинтеза белка – легли в основу молекулярной биологии и молекулярной генетики. Этот начальный период бури и натиска завершился химико-ферментативным синтезом структурного гена аланиновой тРНК дрожжей – событием, которое далеко не все тогда оценили по достоинству. Для скудных методических возможностей того времени это был феноменальный coup de force, потребовавший пятилетних усилий группы высококвалифицированных химиков и биохимиков под руководством Гобинда Кораны, чтобы быть выполненным, и целого номера "Journal of Molecular Biology", чтобы быть описанным. Шокированный последним обстоятельством, журнал "Nature New Biology" устами своего рецензента заявил: «Подобно проекту “Аполлон”, все это сделано лишь для того чтобы показать, что это можно сделать, и, как и этот проект, никогда не будет повторено». Редко случается, чтобы пророчество оказалось настолько бездарным: последующие годы принесли сотни искусственных синтезов такого рода, причем во многих из них использовались основополагающие разработки Кораны. Протагонистом противоположной точки зрения явился Артур Корнберг, который сказал, обращаясь к Коране: “То, что Вы сделали, – это атомная бомба 1980 года”.

Первый синтез гена явился предшественником растянутого во времени большого методического взрыва 1970–1980-х годов в молекулярной биологии. К самым ярким вехам этого взрыва, наряду с олигонуклеотидным синтезом (с переходом его от искусства к ремеслу), можно отнести эндонуклеазы рестрикции, молекулярное клонирование, секвенирование нуклеиновых кислот и полимеразную цепную реакцию. В сочетании с многими другими находками, перечислить которые невозможно, это сделало молекулярную биологию методически почти всемогущей. Будущее покажет, достаточно ли этого, чтобы сбросить покровы с тайны живого.

Бурный поток оригинальных публикаций делает особенно важным жанр обзора в различных его видах. Книга – сложнейший из них, хотя современные возможности работы с литературой далеко отодвинули пределы осуществимого в этой области. Л.И. Патрушев поставил перед собой трудную задачу в одиночку охватить значительную часть современного массива достижений и перспектив молекулярной и клеточной биологии, непосредственно связанную с нуклеиновыми кислотами. На этом пути он сумел сделать удивительно много. Достаточно просмотреть оглавление, чтобы убедиться, что в книге не оставлены без внимания почти все основные направления, имеющие прямое отношение к нуклеиновым кислотам. При этом использован новейший материал, включая множество данных, опубликованных в этом году. Работа не прекращалась ни на минуту, и даже последние числа минувшего октября были свидетелями рождения новых разделов. В результате создано большое молекулярно-биологическое полотно, в котором каждый – от студента до (как это ни кощунственно) академика – может найти для себя что-то неожиданное.

По способу изложения материала квалифицировать книгу непросто. Ее не назовешь учебником в строгом смысле слова, хотя систематичность и внутренняя логика несомненны. Нередко от читателя требуется солидная подготовка, способность истолковывать аллюзии и проскакивать над эллипсисами. Зато удовлетворение от проникновения в материал очень велико.

Эта книга – не просто крупномасштабная компиляция. На ней отчетливо видна печать личности автора. Чувствуется, как небезразлично ему все то, что вот уже несколько десятилетий происходит на огромном пространстве молекулярной биологии. Многое ему удалось превосходно, хотя подстерегающие на этом пути тернии пристрастия, в частности несбалансированной нежности к порождениям собственного разума, не всегда увиты лаврами. В то же время, именно таков путь к звездам единой точки зрения, может быть, даже всеохватывающей концепции – в определенном смысле аналога единой теории поля, мысли о которой когда-то превратили в интеллектуальную трагедию закат великого физика.

Предлагаемая книга – плод эрудиции, вдохновения и самоотверженного труда Л.И. Патрушева и тех, чьи мысли и дела он цитирует, обсуждает, превозносит или критикует, – несомненно найдет множество благодарных читателей.

Ю. Берлин

Ноябрь 1999 г.

Предисловие автора

Мы можем понять что-то в природе, только если мы размышляем о ней…

Вернер Гейзенберг

Предметные исследования, осознанно устремляясь к границам и истокам нашего бытия, становятся философскими.

Карл Ясперс

Направления молекулярной генетики, основанные на генной инженерии, начало которым было положено в 1970-х годах работами В. Арбера, П. Берга, Г. Бойера, С. Коэна и других зарубежных ученых, получили в последующие 25 лет стремительное развитие, открывшее новые горизонты биологической науки. Сегодня трудно представить себе какой-либо раздел молекулярной биологии или генетики, в котором не применялись бы достижения этих исследований. Области использования методов молекулярной генетики непрерывно расширяются, все больше охватывая, к примеру, фундаментальную и клиническую медицину, судебно-следственную практику и даже палеонтологию. Однако все эти достижения – лишь внешняя, хорошо видимая часть айсберга. Замена поврежденных генов на здоровые в генотерапии и "клонирование" многоклеточных организмов придают нашей жизни совершенно новое, грозное качество, так как ставят перед человечеством неведомые ранее этические проблемы. Для меня несомненно, что именно с 70-х годов XX в. начался новый этап эволюции биосферы Земли, все последствия которого мы еще не в состоянии предвидеть.

Работая, как и большинство из нас, в узкой области молекулярной генетики, я часто затрачивал значительные усилия на поиск сведений о каком-либо новом методе или молекулярном механизме, описание которых можно найти иногда лишь в труднодоступной англоязычной литературе. Постоянное общение с коллегами показывает, что блуждания по научной литературе в поисках ответа на теоретические вопросы, возникающие в процессе экспериментальной работы, не являются исключительно моими трудностями. Поэтому стремление сохранить время и облегчить жизнь коллегам-экспериментаторам было одной из движущих сил, заставивших написать эту книгу.

Однако не только указанная причина побудила меня взяться за перо. Оборотной стороной лавинообразного накопления научной информации является размывание контуров целостной картины современных молекулярно-генетических знаний. В соответствии с формулировкой Г. Вейля (берущей начало от Г. Галилея), метод естественных наук включает в себя пассивное наблюдение, уточняемое с помощью активного эксперимента, и построение символической конструкции, к которой в конечном счете сводятся естественно-научные теории. Высшей формой символической конструкции является математическая формула. На пути к своей цели – символической конструкции, непротиворечиво объединяющей эмпирические факты, – естественно-научные теории неизбежно проходят предварительные стадии, в том числе и стадию классификации или морфологии.

То, что в основном происходит сегодня в нашей молодой области биологии, напоминает скрупулезные усилия ботаников или зоологов-систематиков, стремящихся как можно полнее описать фауну и флору нашей планеты. Открываются все новые и новые гены, ферменты, биохимические механизмы и метаболические пути, которые переплетаются в сложнейшие сети. Миллиарды пар оснований отсеквенированных последовательностей ДНК призваны внести ясность в наше понимание структуры и функционирования генома. И хотя это совершенно закономерный и необходимый этап развития науки, одних только эмпирических фактов явно недостаточно для наступления ясности.

Складывающуюся ситуацию, в частности хорошо иллюстрирует положение в современной онкологии. Громадные усилия и средства, затрачиваемые в мире на изучение молекулярных механизмов канцерогенеза, приносят обильные плоды в виде новых генов и белков-регуляторов клеточного цикла, передачи сигнала и механизмов регуляции апоптоза. Однако прямолинейные попытки управления экспрессией этих конкретных генов с помощью антисмысловых РНК, рибозимов, анти-генов и других современных молекулярно-генетических подходов пока не привели к удовлетворительным результатам в генотерапии онкологических (и каких-либо других системных) заболеваний. Заболеваемость раком, в том числе и в промышленно развитых странах, непрерывно возрастает и по прогнозам Всемирной организации здравоохранения к 2020 году удвоится. Пока не слишком успешными остаются и попытки борьбы со СПИДом. Такого рода факты ясно показывают, насколько далеки мы сегодня от понимания живого организма как целого.

Кроме эмпирических фактов требуются новые обобщающие идеи и в конечном счете фундаментальные символические конструкции, которые бы продвинули генетику на пути понимания законов генетического контроля жизнедеятельности клетки и организма в целом. В этой связи не менее важной целью написания книги была попытка систематизировать современные достижения в исследовании механизмов регуляции экспрессии генов на всех основных уровнях реализации генетической информации и обсудить ряд новых концепций, рожденных в ходе исследований. Я надеялся, что некоторые не слишком широко известные факты в свою очередь помогут генерировать новые знания. Однако книга не является полностью компилятивной. Наряду с современной классикой в ней представлены и результаты оригинальных исследований, которые включают, в частности концепции ксенобиоза и альтруистичной ДНК, а также гипотезы о функциональном значении редактирования РНК на посттранскрипционном уровне и образовании доминантных мутаций с участием антисмысловых РНК.

Книга состоит из двух частей. В первой части рассматриваются молекулярные механизмы, обеспечивающие хранение генетической информации живых организмов и ее реализацию через экспрессию генов. При этом основное внимание уделяется генетическим системам эукариот. Поскольку любой ген существует благодаря передаче его точной копии соматическим клеткам и в ряду поколений организмов, в конце первой части обсуждаются механизмы репликации ДНК, репарации ее повреждений, а также другие способы стабилизации генетической информации.

Вторая часть книги посвящена обсуждению современных достижений молекулярной генетики в ее прикладных областях. Однако использование термина "прикладные" в этом контексте не совсем корректно. Результаты, полученные в исследованиях трансгеноза, рибозимов или при решении задач белковой инженерии изменили облик всей современной генетики и потребовали пересмотра многих теоретических представлений.

К сожалению, ограничения в объеме книги не позволили реализовать в ней первоначально задуманную главу "Гены и фенотип", а также обсудить современные достижения в исследовании рекомбинации ДНК. По тем же причинам упомянуты не все авторы, работы которых обсуждаются в монографии. Им я приношу свои глубокие извинения. Исчерпывающую библиографию можно найти в современных обзорах из списка рекомендованной литературы, которая предназначена для более глубокого знакомства с предметом.

На протяжении всей книги мне хотелось подчеркнуть единство генетических систем организма. Отдельное рассмотрение систем транскрипции, трансляции, репарации или репликации условно, поскольку их функционирование в клетке тесно взаимосвязано. На это указывает, в частности высокая интеграция многочисленных механизмов внутриклеточной передачи сигнала, полифункциональность отдельных белков и ферментов, колоссальное разнообразие летальных мутаций и плейотропность действия генов.

Работая над книгой, я всегда имел в виду, что ясное представление о целом может быть хорошим помощником в исследовании частных генетических проблем. Но и сама генетика является лишь малой частью творения духа человека. В лаборатории, клинике, на пленэре или в мастерской мы пишем этюды к большой картине, которой, к счастью, никогда не суждено быть завершенной. И в те редкие минуты, когда работа идет особенно хорошо, отчетливо ощущаешь причастность к этому великому движению духовных сфер, во многом определяющему смысл нашей жизни.

В заключение предисловия хочется выразить особую признательность дирекции и Ученому совету Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН за оказанную поддержку в издании книги.

Работа над книгой проходила параллельно с экспериментальными исследованиями в стенах лаборатории биотехнологии ИБХ, руководимой А.И. Мирошниковым, в лице которого я нашел полное понимание. За это я хочу принести ему свою искреннюю благодарность.

Мое мировоззрение как генетика начало складываться и во многом определилось в аспирантуре на семинарах Р.Б. Хесина, а также при личном общении с этим замечательным человеком и сотрудниками его лаборатории. Ко всем этим людям, ученым и учителям, с которыми мне посчастливилось работать в начале жизненного пути, я храню чувство глубокой благодарности.

Я отдаю себе отчет в том, что монография никогда не была бы написана без высокого профессионализма, постоянного интереса и дружеского участия заведующей научно-информационным отделом Института Т.И. Соркиной, от которой исходит сама идея этого издания. В долгих и плодотворных дискуссиях с ней обсуждалась общая структура книги и содержание отдельных глав, а также многочисленные технические детали, о которых перед началом работы я, к сожалению, не имел ни малейшего представления. Одновременно я приношу свою глубокую благодарность сотрудникам отдела В.В. Егоровой, Т.И. Яковлевой, И.М. Приваловой и Л.И. Петровой за большую техническую помощь при подготовке рукописи к печати.

Хотелось бы выразить искреннюю признательность Е.Д. Свердлову за жесткую и конструктивную критику первых двух глав монографии, которая оказала сильное влияние на всю дальнейшую работу над книгой. Сейчас невозможно представить себе выход монографии в свет без учета многочисленных глубоких замечаний Ю.А. Берлина, у которого я многому научился в ходе нашего продолжительного общения.

Пользуясь случаем, хотелось бы выразить особую признательность всем зарубежным коллегам, приславшим оттиски своих недавних публикаций.

И в заключение, но не в последнюю очередь, я хотел бы от всей души поблагодарить свою жену Раю, такт, мудрость и душевная аура которой, несмотря на все мои недостатки, помогают поддерживать творческую атмосферу в семье. Без всего этого написание книги было бы невозможно.

Неоценимая помощь профессионалов не снимает с меня ответственности за фактическую сторону материала, представленного в монографии. Я буду благодарен за любую конструктивную критику всех спорных интерпретаций генетических фактов, а также замеченных ошибок и неточностей, которые, к сожалению, чаще всего можно увидеть только на расстоянии.

Л.И. Патрушев

ЧАСТЬ I. МЕХАНИЗМЫ ХРАНЕНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

ВВЕДЕНИЕ

Организм. Живой организм представляет собой самовоспроизводящуюся, открытую термодинамическую систему, в которой пути превращения вещества и энергии определяются генетической информацией, реализующейся через генетический код. В таком несколько измененном определении М. Барбьери (1998 г.) сформулирован один из фундаментальных принципов биологии конца XX в. Сама возможность появления этого глобального обобщения, по мнению Барбьери, связана с тремя крупнейшими прорывами в биологических исследованиях уходящего века. Биохимиками была определена функциональная роль белков, генетикам удалось приподнять завесу над миром генетической информации, а молекулярные биологи установили, что связь между этими двумя мирами осуществляется через генетический код.

Поскольку организм является самовоспроизводящейся системой, он должен обладать информацией, необходимой и достаточной для поддержания своего status quo и производства себе подобных. Словосочетание открытая термодинамическая система подчеркивает, что все проявления жизнедеятельности организма могут быть объяснены в терминах естественных наук, а одним из необходимых условий его существования является обмен с окружающей средой веществом, энергией и информацией в разных формах, включая генетическую информацию.

По современным представлениям вся генетическая информация живого организма содержится в его генах и, как любая другая информация, заключает в себе сообщения, в данном случае сообщения для молекулярных объектов, способных их воспринять. Сама возможность восприятия генетической информации определяется тем, что сообщения организованы с помощью системы правил (генетического кода), "понятных" объектам, для которых эти сообщения предназначены. Получив генетическое сообщение, молекулярный объект его декодирует в соответствии с правилами, лежащими в основе функционирования его составных частей. Даже частичное невыполнение этих правил может приводить к тяжелым нарушениям жизнедеятельности организма.

Во время передачи генетической информации по существующим каналам связи от генов к воспринимающим молекулярным объектам имеет место ее многократное декодирование и перекодирование вплоть до окончательного воплощения в фенотипических признаках. Происходит экспрессия генов. Можно сказать, что в результате экспрессии генов заключенное в них слово материализуется в деяние. Однако это не более чем метафора: природа без человека лишена членораздельной речи. Было бы непродуктивно, не опираясь на демиурга, искать в строении организмов предсуществующий план, а в действии генов – цель.

Клетка. Клетка является той наименьшей частью организованной материи, которая еще сохраняет все признаки живого. В ней происходят основные события, связанные с экспрессией генов. Лишь в клетке может полноценно реализовываться генетическая информация, заключенная в генах. Рассмотрение генов в отрыве от их естественного внутриклеточного окружения приводит к искусственному разделению генома на функционально оторванные друг от друга фрагменты, созданию емких баз данных последовательностей нуклеиновых кислот. Современные попытки заставить функционировать гены в новом генетическом окружении завершаются в лучшем случае получением нежизнеспособных в природных условиях биореакторов – организмов-сверхпродуцентов собственных или чужеродных белков и метаболитов.

Связь между генами и внутриклеточным генетическим окружением неразрывна. Компоненты клетки, распознавая гены, считывают заключенную в них информацию и декодируют ее. При этом они поддерживают гены в рабочем состоянии и их воспроизводят, создавая точную копию носителя информации, гарантию существования самих себя. Действительно, в ответ на это гены предоставляют инструкции, необходимые для внутриклеточного клонирования самих молекулярных компонентов клеток, а следовательно (по крайней мере, в случае одноклеточных организмов) создания их точных копий. Функционирует единая система, части которой невозможно разъединить, не уничтожив живое. Тем не менее, суть связей между компонентами генетической системы, организованной в клетку, – это не порочный круг. Напротив, рассматривая систему, как единое целое, в ней можно обнаружить внутренний потенциал направленного развития, который реализуется во времени, материализуясь в биосфере.

В этой связи популярные еще и сегодня рассуждения об эгоистическом гене, заставляющем клетку работать только на себя, лишены глубокого смысла. Последовательно оставаясь на такого рода антропоморфных позициях, необходимо признать, что и эгоистически настроенные белки могут рассматривать ДНК как сожителя, существование которого приходится терпеть для воспроизводства самих себя.

"Omnia mea mecum porto![1]" – этот девиз в полной мере применим к одноклеточным организмам. У многоклеточных генетических систем это не так. В данном случае отдельные клетки, составляющие организм, становятся зависимыми друг от друга, создавая неразрывное единство на другом уровне – сомы, или тела. Между клетками происходит контролируемое генами перераспределение функций. При этом клетки разных частей многоклеточного организма могут настолько различаться морфологически, что без проведения специального анализа на молекулярном уровне их невозможно отнести к одной генетической системе, единому организму.

Пролиферация, дифференцировка и апоптоз соматических клеток. Переход к многоклеточности перевел отношения организма с окружающим миром на новый уровень сложности. Многочисленные связи между рецепторами организма и внешними воздействиями, с одной стороны, а также внутренними анализаторами поступающей информации, с другой, обеспечивают максимальную приспособленность организма к условиям существования. Жизнь не прощает ошибок. Все, что неадекватно реагирует на сигналы среды существования, элиминируется естественным отбором. Чем чувствительнее и эффективнее система настроена на окружающий мир (в том числе и внутреннюю среду организма), тем сложнее и изощреннее ее морфологическое воплощение, ее внутреннее содержание.

Пролиферация клеток. В основе развития любого многоклеточного организма, становления системы его органов и тканей лежит деление (пролиферация) клеток. Генетическая программа обеспечивает протекание сложной совокупности биохимических реакций, сопровождаемых созданием точной копии генетического аппарата каждой соматической клетки, ее ростом и делением. Поскольку при каждом делении клеток весь глобальный биохимический процесс циклически повторяется, он получил название клеточного цикла. Индивидуальное (онтогенетическое) развитие, как правило, начинается с первого деления стимулированного к этому яйца (яйцеклетки) и завершается только с наступлением его смерти – распада организма как целого в результате обрыва ключевых внутренних связей между системами его жизнеобеспечения. Основное внутреннее событие жизни организма – деление клеток – находится под строгим внутренним и внешним генетическим контролем. Даже изолированная соматическая клетка способна лишь к ограниченному количеству делений в питательной среде. Количественный контроль числа клеточных делений лежит в основе органогенеза (формирования органов и тканей). Нарушение механизмов контроля пролиферации клеток приводит к безудержному делению клеток, образованию бесформенной клеточной массы – опухоли, способной задушить организм изнутри. Однако в процессе нормального онтогенетического развития изменяется не только число соматических клеток, но и их качественный состав.

Дифференцировка клеток. Способность органов и тканей осуществлять свои специфические функции целиком зависит от наличия в них специализированных клеток. В частности, организм взрослого человека составлен из ~10¹⁴–10¹⁵ клеток более чем 100 различных типов. На самых ранних стадиях развития зародыша многоклеточного организма составляющие его клетки внешне очень похожи друг на друга. По мере продолжения онтогенеза пути многих из них далеко расходятся. Происходит дифференцировка клеток, приобретение ими специализированных функций. Морфологические различия, выявляемые у специализированных клеток, определяются особым составом и внутриклеточной организацией их молекул. Появление таких особенностей на молекулярном уровне также контролируется генами. В специализированных (дифференцированных) клетках или их предшественниках кроме генов, экспрессирующихся в клетках всех типов, работают особые группы генов. Переключение экспрессии одних групп генов на другие, подключение к экспрессии новых генов и прекращение работы старых в дифференцирующихся клетках также находится под строгим генетическим контролем.

Апоптоз. Еще одним важным событием индивидуального развития организма является полное замещение одних групп клеток другими. При этом конечные стадии процесса замены контролируются самими замещаемыми клетками. На определенной стадии развития эмбриона в ответ на сигналы окружающих тканей внутри удаляемых клеток происходит активация группы генов, запускающих их саморазрушение – апоптоз. Апоптоз является одним из проявлений принципа самоочищения организма, когда для становления и сохранения целого многоклеточный организм жертвует небольшой частью своих соматических клеток. Действительно, другой не менее важной стороной этого процесса является защита организма от клеток с необратимо поврежденным генетическим аппаратом, поскольку в этом случае возникает опасность их неконтролируемого роста и гибели целого организма. В том случае, если повреждения генетического аппарата клетки невозможно восстановить, клетка совершает самоубийство.

С учетом всего сказанного можно без преувеличения утверждать, что пролиферация, дифференцировка и апоптоз соматических клеток определяют ключевые моменты внутренней жизни многоклеточного организма.

Гены. В соответствии с центральным постулатом молекулярной биологии принято считать, что генетическая информация, необходимая для индивидуального развития организма, заключена в его генах, которые представляют собой последовательности нуклеотидов молекул ДНК и РНК. Гены содержат информацию о составных частях организма: совокупности большого числа высоко- и низкомолекулярных химических соединений, образующих его клетки, ткани и органы. При этом данные о структуре почти всех низкомолекулярных соединений, называемых метаболитами, закодированы в генах не прямо, а косвенно. Фактически эта информация является лишь программой биосинтеза метаболитов. Сама же структура и взаимодействие метаболитов друг с другом определяются биологическими катализаторами белковой природы – ферментами, которые и осуществляют необходимые их взаимопревращения – метаболизм.

Генетическая информация о структуре белков и ферментов скрыта в генах не так глубоко. Благодаря существованию универсального триплетного генетического кода, последовательности нуклеотидов генов однозначно определяют последовательности аминокислот полипептидных цепей конкретных белков. Декодирование информации о структуре белков и нуклеиновых кислот, сопровождаемое их биосинтезом, является важнейшим промежуточным (но не конечным) результатом функционирования (экспрессии) генов любого организма.

Экспрессия генов. В норме экспрессия генов обеспечивает существование организма как целого от начальных до завершающих стадий индивидуального развития – от первых делений стимулированной яйцеклетки до естественной смерти организма. Однако более широкий подход к проблеме экспрессии генов должен учитывать не только биохимические последствия их работы на молекулярном, надмолекулярном и организменном уровне, но и генетически детерминированные поведенческие реакции групп особей в популяции, а следовательно, и механизмы генетического контроля развития самих популяций, включая цивилизацию.

При реализации запрограммированных фенотипических эффектов работающие вместе гены и продукты их экспрессии правильно декодируют адресованные им (и только им) регуляторные сообщения на всех уровнях и адекватно на них отвечают. Адресная доставка и расшифровка как регуляторных сигналов, так и самой генетической информации, заключенной в генах, становятся возможными благодаря осуществлению высокоспецифических молекулярных взаимодействий.

Специфичность всех биохимических реакций обеспечивается способностью высокомолекулярных соединений организма безошибочно распознавать друг друга и низкомолекулярные метаболиты. Специфическое межмолекулярное узнавание, которое определяет упорядоченное протекание всех генетических процессов, осуществляется, по крайней мере, на трех уровнях. На первом уровне (в соответствии с последовательностью основных событий, происходящих при реализации генетической информации) имеет место специфическое распознавание друг друга нуклеиновыми кислотами. Цепи одной молекулы ДНК взаимодействуют между собой по принципу комплементарности в соответствии с правилами Уотсона–Крика, что характерно и для соответствующих контактов ДНК с РНК, а также для взаимодействия молекул РНК друг с другом. Такой тип взаимодействий лежит в основе самовоспроизведения генетической информации и ее передачи от нуклеиновых кислот к нуклеиновым кислотам или белкам. Второй уровень обеспечивается белково–нуклеиновым узнаванием. Этот крайне важный тип взаимодействий регулирует экспрессию генов и способствует упорядоченному метаболизму нуклеиновых кислот. И, наконец, взаимодействие белков друг с другом, с иными макромолекулами клеток или с низкомолекулярными лигандами делает возможной сборку молекулярных и надмолекулярных комплексов, обеспечивающих направленное протекание метаболических процессов, и лежит в основе морфогенеза организмов. Кроме всего прочего, этот тип взаимодействий может изменять специфичность действия белков и индуцировать в них новую активность.

Постепенно становится ясно, что во время реализации генетической информации в процессе биосинтеза нуклеиновых кислот, белков и ферментов формируются сложные пространственные структуры из белков и нуклеиновых кислот в результате их самоорганизации, часто при участии других молекул клетки. Самоорганизация синтезированных макромолекул приводит к образованию пространственных внутриклеточных межмолекулярных структур, клеточных органелл и, в конечном счете, самих клеток, которые в совокупности создают многоклеточный организм, законы функционирования и предназначение которого во многом остаются непонятными и сегодня.

Дата добавления: 2015-08-18