Міжмембранний простір

зниження рН з 9 до 7;

наявний валіноміцин, відсутній К⁺

Рис. 19-21 Механізм каталітичної дії F₁. (а) Наведено результати експерименту по обміну ¹⁸О. Виділений з мітохондріальних мембран компонент F₁ інкубують у середовищі з АТР і ¹⁸О-міченою водою. Через певні проміжки часу відбирають зразки розчину та аналізують включення ¹⁸О до складу Р_і, відщепленого від АТР у ході гідролізу. Вже через декілька хвилин у складі Р_і виявляють три або чотири атоми ¹⁸О. Це свідчить про те, що упродовж інкубації відбувається декілька актів гідролізу АТР та синтезу АТР. (б) Ймовірна структура комплекса у перехідному стані під час гідролізу та синтезу АТР (взято з PDB ID 1BMF). Зеленим кольором позначено α-субодиницю, сірим - β -субодиницю. Позитивно заряджені залишки β -Arg¹⁸² та α -Arg³⁷⁶ утворюють координаційні зв’язки з двома атомами кисню у складі п’ятивалентної фосфатної проміжної сполуки; залишок β -Lys¹⁵⁵ взаємодіє з третім атомом кисню, іон Mg²⁺(зображений як зелена кулька) стабілізує сполуку ще більшою мірою. Блакитною кулькою представлено групу, яка витісняється (Н₂О). Такі взаємодії призводять до швидкого встановлення рівноваги між АТР та ADP+P_і в активному центрі.

Ензим

Рис. 19-22 Координатні діаграми реакції, здійснюваної АТР-синтетазою та іншим типовим ензимом. Головним енергетичним бар’єром у типовій каталізованій ензимом реакції (ліворуч), який необхідно подолати, є досягнення перехідного стану (†) між субстратом та продуктом. У реакції, яку каталізує АТР-синтаза (праворуч) головним енергетичним бар’єром є від’єднання АТР від ензиму, а не утворення АТР. Величина зміни вільної енергії у реакції утворення АТР з АDР та Р_і у водному середовищі є високою і позитивною, однак АТР настільки міцно зв’язується на поверхні ензиму, що цієї енергії зв’язування вистачає для того, щоб наблизити величину вільної енергії зв’язаного з ензимом АТР до величини вільної енергії АDР+Р_і, а тому реакція є оборотною. Величина константи рівноваги реакції дорівнює 1,0. Вільну енергію, необхідну для вивільнення АТР, забезпечує протонорушійна сила.

кДж/моль АТР (у розчині)

Координата реакції Типовий ензим АТР-синтаза

Рис. 19-23. Мітохондріальний АТР-синтазний комплекс. (а) Структура комплекса F₁, встановлена на підставі даних кристалографічних та біохімічних досліджень. Три α-субодиниці (затінені сірим) та три β -субодиниці (затінені фіолетовим) у складі F₁, подібно до дольок помаранча, почергово упорядковані навколо центрального стержня - g субодиниці (зеленого кольору). (б) Кристалічна структура F₁ мітохондрій бика (PDB ID 1BMF), вигляд збоку. Дві α- та дві β- субодиниці видалено для того, щоб було видно центральний стержень (g- субодиницю), а також центри зв’язування АТР (червоного) та ADP (жовтого кольорів) у складі β - субодиниць. На схемі відсутні також δ- та e- субодиниці. (в) Вигляд F₁ зверху (з N- сторони мембрани), зображено три β- та три α-субодиниці, а також центральний стержень (g-субодиниця, затінена зеленим). Кожна β- субодиниця на межі з сусідньою α-субодиницею містить нуклеотид-зв‘язувальний центр, необхідний для каталітичної активності. Єдина g-субодиниця зв’язується спочатку з однією із трьох пар αβ-субодиниць, змушуючи кожну з трьох β-субодиниць дещо змінити конформацію нуклеотид-зв’язувального центру. На схемі кристалічної структури видно, що одна з субодиниць (β-ADP) містить у своєму зв’язувальному центрі молекулу ADP (жовтого кольору), наступна субодиниця (β-AТP) містить молекулу АТР (червоного кольору), тоді як третя субодиниця (β-порожня) не містить зв’язаного нуклеотиду. (г) Структура комплексу F₀F_1, вигляд збоку. Це змішана структура, у якій поєднано кристалографічні координати компонента F₁ мітохондрій бика (затінено фіолетовим та сірим) та координати компонента F₀ мітохондрій дріжджів (затінено жовтим та помаранчевим) (PDB ІD 1QO1). На цій схемі кристалічної структури не представлено субодиниці a, b, δ та e. (д) Структуракомплексу F₀F₁, вигляд з торця у напрямку від P- до N- сторони мембрани. Великі структури, які видно на цьому поперечному зрізі, - це дві трансмембранні спіралі кожної з десяти с -субодиниць, упорядкованих у концентричні кільця. (є) Діаграма комплексу F₀F₁, побудована на основі даних біохімічних та кристалографічних досліджень. Дві b-субодиниці компонента F₀ міцно зв’язуються з α- та β-субодиницями компонента F₁ і утримують їх у фіксованому положенні стосовно мембрани. Побудована з с- субодиниць і занурена у мембрану циліндрична частина F₀ прикріплюється до стержня, утвореного g- та e- субодиницями компонента F₁. Коли протони перетікають через F₀ у напрямку від Р-сторони до N-сторони мембрани, циліндр і стержень обертаються, g-субодиниця по черзі зв’язується з кожною з β-субодиниць, які внаслідок цього змінюють свою конформацію.

(в) α-порожня β-порожня

(є) N-сторона Р-сторона

Рис. 19-24 Модель функціонування АТР-синтази (модель «зв’язування – зміни», англ. - binding-change model). Комплекс F₁ містить три нееквівалентні аденіннуклеотид-зв’язувальні центри, по одному на кожну пару α- та β -субодиниць. У будь-який заданий момент часу один із цих центрів перебуває у β -АТР-конформації (тобто, міцно зв’язує АТР), другий - у β- АDР-конформації (зв’язування слабке), а третій – у β -порожній конформації (зв’язування дуже слабке). Протонорушійна сила спричиняє обертання центрального стержня - g-субодиниці (вказано зеленою стрілкою), яка по черзі вступає у контакт з кожною парою субодиниць αβ. Це викликає кооперативну зміну конформації нуклеотид-зв’язувальних центрів: центр β -АТР набуває β -порожньої конформації і АТР від’єднується; центр β -АDР набуває β -АТР-конформації, яка прискорює конденсацію зв’язаних ADP + P_і з утворенням АТР; β -порожній центр стає β -АDР-центром, який не міцно зв’язує ADP + P_і, що надходять із середовища. Ця побудована на основі експериментальних даних модель передбачає, що активність принаймні двох з трьох каталітичних центрів почергово змінюється; АТР не може від’єднатися від одного центра доти, доки до іншого центра не приєднаються ADP + P_і .

Рис. 19-25. Експериментальне підтвердження обертання комплекса F₀ та g -субодиниці. Генетично сконструйований комплекс F₁, що містить низку залишків Нis, щільно прилипає до вкритого нікелевим комплексом предметного мікроскопічного скельця; до с-субодиниці F₀ ковалентно приєднують біотин. Протеїн авідин, який міцно зв’язується з біотином, ковалентно приєднують до довгого актинового філамента, поміченого флюоресцентною міткою. Завдяки зв’язуванню біотину з авідином актиновий філамент прикріплюється до с-субодиниці. Якщо у середовище додати АТР у якості субстрата для АТРазної активності компонента F₁, то можна побачити, як мічений філамент починає обертатися в одному напрямку, що свідчить про обертання F₀-циліндра, складеного із с-субодиниць. В іншому експерименті флюоресцентно-мічений актиновий філамент приєднали безпосередньо до g-субодиниці. На серії мікрофотографій, зроблених з інтервалом у 133 мс, відображено зміну положення актинового філамента. Зверніть увагу, що під час обертання філамент здійснює дискретні стрибки приблизно через кожні одинадцять кадрів. Очевидно, що циліндр і стержень обертаються разом.

Актиновий філамент Авідин Залишок His Залишок His

Комплекс Ni

Рис. 19-26 Аденіннуклеотидтранслоказа та фосфаттранслоказа. Транспортні системи внутрішньої мембрани мітохондрій переносять ADP та Р_і у матрикс, а новосинтезований АТР – у цитозоль. Аденіннуклеотидтранслоказа є антипортером, тобто один і той же протеїн транспортує ADP у матрикс, а АТР - назовні. Унаслідок заміни АТР^4- на ADP^3- один негативний заряд виводиться з матриксу, цьому сприяє різниця у заряді між двома сторонами внутрішньої мітохондріальної мембрани (зовнішня сторона заряджена позитивно). За рН 7,0 Р_і існує у двох форах - НРО₄^2- та Н₂РО₄^-; фосфаттранслоказа специфічна до Н₂РО₄^-. Симпорт Н₂РО₄^- та Н⁺ не супроводжується сумарним витоком заряду, проте завдяки відносно низькій концентрації протонів у матриксі переміщення Н⁺ всередину мітохондрій полегшується. Таким чином, енергія протонорушійної сили використовується як для синтезу АТР, так і для транспортування субстратів реакції (ADP та Р_і) у мітохондріальний матрикс, а продуктів (АТР) – у цитозоль. Усі три транспортні системи можна виділити у вигляді єдиного мембранозв’язаного комплексу (АТР-синтасоми).

Дата добавления: 2015-08-18