ТП.2 Выращивание посевного материала в инокуляторе

Вегетативный посевной мицелий выращивает в иноклуляторе (поз.21), объемом 0,1м³.

ТП.2.1 Подготовка инокулятора

С разрешения мастера открывают люк, тщательно промывают внутреннюю поверхность аппарата питьевой водой из шланга, затем набирают воду до покрытия барботёра и, пропуская воздух, проверяют его работу. При равномерном выходе воздуха из барботёра последний считают чистым. В случае если воздух проходит через барботёр неравномерно, проводят чистку отверстий, пропуская через бартёр пар. Промывные воды сливают в промышленную канализацию.

Если предыдущая операция была нестерильна, перед сливом содержимого проводят проверку аппарата на герметичность при давлении воздуха 0,12-0,15 МПа. Массу нагревают до 100-110⁰С, подачей острого пара через все коммуникации и выдерживают 30 минут.

Содержимое аппарата, после предварительной убивки, вывозят в специально отведенное место.

В аппарат, подлежащий мойке, заливают небольшое количество воды, загружают едкий натр, до концентрации 3-5%. Доливают воду до люка, аппарат герметично закрывают, нагревают острым паром до 90-100⁰С при работающей мешалке и открытой воздушке. Делают выдержку при этой температуре в течение часа, затем содержимое аппарата охлаждают до температуры 35-45⁰С и передают в другой аппарат (допускается трехкратное использование моющего раствора). После промывают аппарат водой и приступают к его ремонту.

Во время ремонта производят внутренний осмотр аппарата, проверяют крепление трубы барботёра, лопастей и муфт мешалки, заменяют прокладки вентилей входа и выхода, пробоотборника, прокладку люка, проверяют уплотнение вала мешалки.

Выявленные дефекты устраняют, закрывают люк и аппарат проверяют на герметичность при давлении воздуха 0,12-0,15 МПа с помощью мыльного раствора. Проверяют герметичность фланцевых соединений, сварных швов, уплотнений сальников и вала мешалки, посевного штуцера, места уплотнений по резьбе манометра, прокладок крышки аппарата и люка. Давление в аппарате не должно падать в течении 30 минут. Если герметичность не достигнута, выявленные дефекты устраняют и аппарат снова проверяют на герметичность.

Отремонтированный герметичный аппарат стерилизуют острым паром в течении 1-1,5 часов при температуре 130-135⁰С и давлении 0,19-0,22 МПа. Подачу пара ведут через все подводящие трубопроводы: барботёр, пробоотборник и посевную линию. При достижении температуры 125⁰С, начинают стерилизацию посевного штуцера, открыв его на 2-3 оборота, стерилизуют в течении 30 минут. После стерилизации посевной штуцер закрывают. При достижении температуры 130-135⁰С и давления 0,19-0,22 МПа отмечают начало стерилизации и стерилизуют 1-1,5 часа. Первые 30 минут стерилизуют при открытой воздушке (для ее стерилизации), затем вентиль закрывают.

По окончании стерилизации прекращают подачу пара и начинают охлаждать аппарат подачей воды в рубашку. При давлении в аппарате 0,06-0,08 МПа паровое давление меняют на воздушное и приступают к приготовлению питательной среды.

ТП.2.2 Приготовление и стерилизация питательной среды

Цель стадии – получить стерильную охлажденную питательную среду для дальнейшего выращивания инокулюма.

Питательная среда должна иметь обогащенный состав, близкий по составу ферментационной среде, однако компоненты в ней присутствуют в меньшем количестве.

Основная цель – сокращение периода адаптации микроорганизма к условиям окружающей среды и наращивание биомассы культуры.

В питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых строится клетка (элементы-органогены, растворенные в воде соединения – макро- и микроэлементы).

Органическим источником азота является соевая мука и кукурузный экстракт. Азот необходим на синтез белков микроорганизма.

Соевая мука богата аргенином (до 15,7% аргенина по азоту) и является источником белка, эти белки не могут проходить через клеточную мембрану микроорганизмов. В связи с этим, они гидролизуются внеклеточными протеазами продуцента до олигопептидов и свободных аминокислот. Благодаря наличию систем переноса веществ, они проникают в клетку, где олигопептиды гидролизуются внутриклеточными пептидазами до аминокислот.

На производстве питательную среду, содержащую соевую муку предварительно готовят, суспензию заваривают. Заваривание суспензии проводят для облегчения утилизации соевой муки микроорганизмом, т.е. расщепления её протеолитическими ферментами продуцента. Кроме того, после заваривания соевая мука равномерно (без комочков) распределяется по всему объему аппарата.

Соевая мука является очень пеногенным компонентом, вызывая сильно вспенивание культуральной жидкости в процессе культивирования. В процессе заваривания, белки соевой муки частично денатурируются, что уменьшает способность её к пенообразованию.

Адеканоль - синтетический пеногаситель. Его добавляют в среду для предотвращения пенообразования.

Кукурузный экстракт – это густая, непрозрачная, однородная жидкая масса от светло-желтого до темно-коричневого цвета. Кукурузный экстракт – это побочный продукт кукурузно-паточного производства. Он является источником азотного питания, содержит относительно небольшое количество белковых соединений и большое количество свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов. Именно это определяет особую питательную ценность кукурузного экстракта, так как в аминокислотах азот находится в восстановленной форме, то есть в той форме, которая легко ассимилируется микроорганизмами. Также в состав кукурузного экстракта входит зола (20-24%). Основной компонент золы является фосфор, калий и магний, причем общее содержание фосфора достигает 5%. Кукурузный экстракт обладает буферными свойствами (определенная устойчивость концентрации ионов водорода, которая мало изменяется при добавлении небольших количествах сильных кислот и щелочей). В его составе присутствуют аминокислоты и органические кислоты, что придает ему в зависимости от содержания этих веществ – основные или кислотные свойства (группировки NH₂ – и –COOH). В связи с этим, при приготовлении питательной среды кукурузный экстракт нагревают с мелом. При этом протекают реакции нейтрализации кислот, и кукурузный экстракт теряет свою буферность, что в дальнейшем позволяет установить в питательной среде необходимое значение pH.

Кукурузную муку получают при размалывании зерен кукурузы. Она содержит: крахмал – 67-70%, другие углеводы (клетчатка,пентазаны, декстрины, растворимые углеводы) – 10%; белки – 12%; зольность – 0,9%; влажность не выше 15%.

Питательную среду для выращивания культуры, готовят в смесителе (поз.6).

Смеситель для приготовления питательной среды для инокулятора представляет собой аппарат с плоским днищем и крышкой. Работает под атмосферным давлением, оснащен рамной мешалкой (чтобы происходило меньше вспенивания), гладкой приварной рубашкой, загрузка через люк, выгрузка через нижний спуск с помощью насоса (поз.12).

В аппарат через люк при работающей мешалке загружают питьевую воду, добавляют навеску кукурузной муки, взвесив на весах (поз.1), нагревают глухим паром до температуры 70-88⁰С. И при этой температуре разваривают муку в течении 30 минут при включенной мешалке.

Затем добавляют навески мела, соли предварительно разведённые водой и тщательно перемешанные. В смеситель также поступает кукурузный экстракт из сборника (поз.4) при помощи насоса (поз.8). Доводят рН до 6,9-7,1 40% раствором щелочи, который насосом (поз.15) передается из сборника (поз.11). Затем через люк загружают пеногаситель адеканоль.

При непрерывно работающей мешалке приготовленную питательную среду по трубопроводу, предварительно отработанному паром, центробежным насосом (поз.12) передают в инокулятор (поз.21) объем 0,1 м³. Перед насосом (поз.12) стоит мембранный фильтр (поз.10), состоящий из нержавеющей металлической сетки. Он служит для механического удаления комочков в питательной среде. Комочки необходимо удалять для того, чтобы стерилизация среды была эффективная, так как в центре комочка могут не погибнуть микроорганизмы и вероятен риск контаминации.

После передачи питательной среды в инокулятор при закрытой воздушке открывают вентиль подачи воздуха на барботёр. При достижении воздушного давления 0,12-0,15 МПа вентиль подачи воздуха на барботёр перекрывают.

При наборе давления, во избежание попадания среды из инокулятора в индивидуальный фильтр (поз.22), строго соблюдается положение: давление в индивидуальном фильтре на 0,02-0,04 МПа выше, чем на аппарате.

При достижении воздушного давления на аппарате 0,12-0.15 МПа проверяют на герметичность прокладки люка (с помощью мыльного раствора). По окончании проверки люка снимают с аппарата давления, закрывают смотровые стёкла, надевают колпачок на пробоотборник.

При давлении на паровой магистрали 0,25-0,3 МПа, при работающей мешалке, после предварительного спуска воды и конденсата из рубашки, подают острый пар в аппарат: через посевную линии, барботёр и пробоотборник.

При температуре 105⁰С прикрывают воздушку, оставляя ее открытой на 0,5-1 оборот, при температуре 115-117⁰С начинают стерилизацию посевного штуцера, открыв его на 1,5-2 оборота и стерилизуют его в течение 30 минут.

При достижении температуры 127-129⁰С и давлении 0,15-0,17 МПа отмечают начало стерилизации и стерилизуют аппарат со средой в течение одного часа при постоянно работающей мешалке. По окончании стерилизации среды прекращают подачу острого пара в аппарат и начинают охлаждение питательной среды путём подачи захоложенной воды в рубашку аппарата при работающей мешалке.

При снижении давления пара до 0,06-0,08 МПа меняют паровое давление на воздушное. Охлаждение среды ведут до температуры 26-28⁰С, при этом давление в аппарате поддерживают стерильным сжатым воздухом в пределах 0,05-0,06 МПа.

Перед посевом после 30 минутной пропарки пробника, в зоне огня (соблюдая асептику), отбирают пробу среды для определения биохимического состава, рН и стерильности. После отбора проб пробник оставляют на пропарке.

Питательная среда должна иметь следующий биохимический состав:

-крахмал 1-1,7%

-рН 6,9-7,0.

Результаты анализа записываются в микробиологическом журнале.

ТП.2.3 Засев питательной среды и выращивание вегетативного мицелия в инокуляторе

Простерилизованную питательную среду, охлаждённую до 26-28⁰С, засевают мицелием из колб или суспензией спор из колбы посевной культуры Str. Levoris штамм 78.

Посев производится при минимальном движении воздуха в помещении, для чего за 15 минут до посева закрывают окна, двери, прекращают хождения, выключают вентиляцию. Обрабатывают 1% раствором формалина или хлорамина посевной штуцер и прилегающий к нему на крышке аппарата коммуникации. Вокруг посевного штуцера создают зону пламени при помощи горящего кольцевого факела, смоченного этиловым спиртом.

Прекращают подачу воздуха в аппарат, при снижении давления в аппарате до 0, МПа снимают колпачок с посевного штуцера (колпачок в течение всего посева держат в зоне пламени).

В зоне пламени факела снимают ватно-марлевую пробку, обжигают края колбы и содержимое колбы выливают через посевной штуцер в инокулятор, после чего колпачок закрывают.

Открывают вентиль входа воздуха в барботёр, и устанавливают в аппарате давление 0,03-0,05 МПа. Горящий факел переносят к пробнику, прекращают пропарку и отбирают пробу среды после посева на отсутствии посторонней микрофлоры и рН. Затем открывают полностью вентиль подачи стерильного воздуха в барботёр и, регулируя вентиль на воздушке, устанавливают давление в аппарате 0,03-0,05 МПа.

Температуру во время выращивания поддерживают 26-28⁰С, избыточное давление в аппарате 0,03-0,05 МПа. Количество подаваемого воздуха 0,5-0,8 объёма на объём среды в аппарате. Перемешивание мешалкой непрерывное. Температура подаваемого воздуха 50-55^ОС, время выращивания 36-50 часов. Указанные параметры каждый час записываются в микробиологический журнал.

В случае вспенивания добавляют стерильный адеконоль, непосредственно в аппарат через посевной штуцер в зоне пламени кольцевого факела.

Из аппарата асептично через каждые 6 часов отбирают пробы для контроля за стадиями развития гриба, стерильностью, рН, результаты анализа записываются.

Посевной мицелий к моменту передачи его в аппарат должен удовлетворять следующим требованиям:

-рН 6,8-7,0;

-по внешнему виду должен представлять собой густую хлопьевидную массу, заполняющую не менее 1/3 объёма пробы;

-в высевах из исходной посевной колбы питательной среды и всех проб из инокулятора должна отсутствовать посторонняя микрофлора, а также должно быть установлено отсутствие посторонней микрофлоры при микроскопическом исследовании перед посевом;

-при исследовании под микроскопом окрашенного препарата мицелий должен иметь редкое сплетение микроколоний образованное длинными ветвящимися гифами второй стадии развития, протоплазма гиф гомогенна, базофильна.

Перед передачей в посевной аппарат допускается захолаживание посевного мицелия до температуры 18⁰С и хранение его не более 10 часов.

Посевной материал, не отвечающий требованиям, для посева не используют.

Дата добавления: 2015-08-03