ТП.1 Выращевание посевного материала

ТП.1.1 Выращевание посевного материала

Биосинтез леворина осуществляется с помощью Str. Levoris штамм 78.

Через каждые три месяца хранения штамма проводят отбор культуры. Отбор лучшей по активности колонии производят путём посева моноспоровой суспензии актиномицета (суспензии, состоящей из отдельных спор). Для получения суспензии споры с косяка 12-суточного возраста смывают 5 мл физраствора, перемешивают, встряхивают 30 минут на качалке, а затем фильтруют через двойной бумажный фильтр, соблюдая стерильность. Для фильтрования через бумажный фильтр используют колбу на 30-50 мл, со стеклянной воронкой и двумя фильтрами. Сверху воронку прикрывают часовым стеклом или крышкой от чашки Петри, заворачивают бумагу и стерилизуют.

В каждую чашку Петри с агаризованной средой Чапека с крахмалом вносят по 0,1 мл суспензии спор и тщательно распределяют её стеклянным шпателем по поверхности агара. Густоту суспензии спор подбирают таким образом, чтобы с 0,1 мл на чашке вырастало не более 50 колоний. С этой целью суспензию спор разводят стерильным физраствором и серию разведений наносят на чашки. Делают посев 9-12 разведений, и из каждого разведения засевают по 10 чашек Петри с агаром Чапека с растворимым крахмалом, для того чтобы выбрать чашки на которых выросло не более 30-50 изолированных колоний.

Колонии выдерживают в термостате при температуре 28⁰С в течении 12 суток. Затем 100 типичных для данной популяции колоний пересевают на агаризованные косяки того же состава.

Типичные для штамма 78 колонии в рассеве популяции составляют 98-99%, морфологически измененные мутанты 1-2%.

Типичные колонии крупные 9-12 мм в диаметре, плоские с радиальными складками, центр приподнят, край неровный. Воздушный мицелий хорошо развит, мучнистый белый (Д-3); субстратный- буланый (К-1). Среда не окрашена.

Косяки выращивают в течение 12 суток, а потом проводят наиболее активного варианта. Для этого проверяют антибиотическую активность 100 вариантов. Отбирают 5-7 наиболее активных вариантов.

После вторичной проверки этих вариантов, из них выбирают 1-2 наиболее активных, которые используются для приготовления посевной партии.

ТП.1.2 Приготовление посевных партий штамма 78

Наиболее активный вариант служит исходной культурой для приготовления партии посевного материла. С косяка отобранного материала засевают 40-50 пробирок на косяк с подсушенной агаризованной средой Чапека с крахмалом. Косяки выращивают в течение 12 суток. Каждую посевную партию проверяют на стерильность и активность по 10% косяков от каждой партии.

В стандартных условиях выращивания штамма 78 на регламентной ферментационной среде имеет среднюю активность при экстракции бутиловым спиртом 72000 ЕД/мл (колебание активности 68000-8000 Ед/мл).

Для приготовления посевных партий следует использовать косяки с активностью не менее 72000 Ед/мл. Посевные партии штамма 78 хранят не более 3 месяцев в холодильнике при температуре 4⁰С.

Исходным материалом для выращивания вегетативного мицелия служат смытые споры Str. Levoris штамма 78 с косяков. Выращивание проводят на среде следующего состава:

- мука кукурузная 2%

- экстракт кукурузный 0,12% (т.м.)

- соль поваренная 0,5%

- мел химически осаждённый 0,1%

- вода до 1 литра

- рН среды после стерилизации 7,0-7,2.

Приготовленную среду разливают в колбы Эрленмейера, вместимость 750 мл по 100 мл и стерилизуют в автоклаве при паровом давлении 0,07-0,17 МПа в течении 30 минут.

Приготовленную партию колб с посевной средой выдерживают в термостате при температуре 37±1⁰С в течение 48 часов, после чего проверяют на стерильность. В случае если высевы хотя бы одной колбы прорастают, вся партии колб бракуется.

Стерильные питательные среды засевают кусочками агара со спорами, размером 1 см² на колбу. Засеянные колбы ставят на качалку с частотой вращения 3,67-4,0 об/с, при температуре 27-29⁰С в течении 36-48 часов.

Кроме того в пробирку со спорами на агаре в стерильных условиях заливают 10-15 мл физраствора и поле непродолжительного покачивания, соскабливают с поверхности агара петлей содержимое двух косяков (для одного засева), переносят в стерильную колбу с физрастворм в количестве 200 мл. Смыв спор готовят непосредственно перед посевом инокулятора, хранение смытых спор в физрастворе не более суток.

Дата добавления: 2015-08-03