Линия TK6 лимфобластоидных клеток

Из представленной выше табл. 2.6.1 можно видеть, что с 1996 по 2002 гг. для этой линии клеток тремя группами авторов РИНГ продемонстрирована при весьма значительных дозах облучения in vitro — от 1,5 до 4 Гр [AC3, AC15, AD28, AE5, AE6, AE8, AG14, AM29, AR17]. Однако в 2003 г. одной из этих групп был обнаружен эффект нестабильности хромосом (отсроченное повышение частоты дицентриков) не только для доз 1–4 Гр, но и для 0,05 и 0,1 Гр g-излучения [AS16]. РИНГ определялась отчетливо.

Параллельно были исследованы другие линии лимфобластоидных клеток — клетки NH32 и WTK1, которые облучали в дозах 0,1; 1,0 и 2,0 Гр. Применительно к клеткам NH32 для малой дозы эффект был обратным (число нестабильных клонов снижалось), а для дозы в 1,0 Гр отсутствовал (рис. 2.9.1). Трудно сказать, можно ли рассматривать РИНГ в TK6 клетках после воздействия в малых дозах как повреждающий эффект, если перейти на уровень организма. Действительно, TK6 клетки являются клетками «дикого типа» по белку TP53, а линия NH32, которая выведена из TK6, мутантна по этому белку (нокаутирована). Спонтанная частота дицентриков в TK6 клетках была значительно меньше, чем для клеток NH32 и WTK1 [AS16] (см. рис. 2.9.1).

Рисунок 2.9.1. Нестабильность хромосом после облучения различных линий лимфобластоидных клеток (35-е генерации после воздействия) [AS16].

В 2006 г. другая группа авторов подтвердила возможность индукции РИНГ в клетках TK6 по хроматидным аберрациям при малой дозе рентгеновского облучения (0,1 Гр), в том числе и как «эффект свидетеля» [AM28].

Однако широко использующаяся в экспериментальных исследованиях линия лимфобластоидных клеток TK6 не может считаться нормальной вследствие впечатляющего спектра дефектов в репарации ДНК:

v Дефицит по эксцизионной репарации ДНК. После облучения в дозах от 0,01 to 2 Гр в этих клетках не индуцировался на транскрипционном уровне ни один из 10 исследованных факторов эксцизионнной репарации [AI4].

v Относительный дефицит по рекомбинационной репарации ДНК [AA5, AA6, AE7, AX1].

v Дефицит по репарации (воссоединению) двойных разрывов ДНК [AE7, AE9, AO5].

Как результат, клетки TK6 характеризуются следующими феноменологическими аномалиями:

· Повышен спонтанный мутагенез (тестирован локус aprt) [AS41].

· Мутагенным эффектом обладает даже малая доза облучения (0,1 Гр) [AM35].

· Не индуцируется адаптивный ответ после воздействия генотоксических факторов в малых дозах [AP5].

· Повышена чувствительность к химическим агентам [AD7].

· Повышена радиочувствительность [AA6].

Все эти факты не позволяют нам отнести отсроченное повышение частоты аберраций хромосом после облучения клеток TK6 к доказательствам индукции РИНГ малыми дозами радиации с низкой ЛПЭ в клетках без дефектов.

2.9.2. HPV-G кератиноциты человека

К. Мазерсилл с соавторами в 2000 г. было продемонстрировано, что иммортализованные вирусом папилломы, но не трансформированные кератиноциты человека (клетки HPV-16) очень чувствительны к индукции РИНГ после воздействия g-излучения по тесту отсроченной клоногенной выживаемости. Известны три такие работы с малыми дозами радиации [AM39, AM46, AS23]. Аналогично с рассмотренной выше аномальной линией клеток TK6, РИНГ в кератиноцитах экспрессировалась и при прямом облучении, и при помещении необлученных клеток в среду от облученных (т.е., как «эффект свидетеля»). Феномен был зарегистрирован после воздействия в очень малых дозах: при 0,01; 0,03; 0,05; 0,1 и 0,3–5,0 Гр. Зависимость от дозы, как всюду декларируется, почти отсутствовала. Однако из первичных данных работы [AS23] видно, что хотя для доз 0,03–2,5 Гр эффект находился почти на одном уровне, для дозы 0,01 Гр он был меньше более чем в два раза, а для дозы 5 Гр — немного больше (рис. 2.9.2)[124].

Сходные результаты, но уже только для «эффекта свидетеля», причем начиная с 0,005 Гр γ-излучения, были опубликованы К. Мазерсилл и К. Сеймуром в 2002 г., когда они исследовали влияние общего и фракционированного облучения [AM46].

Отдельные данные, полученных при воздействии малых доз на кератиноциты человека, были включены К. Мазерсилл с соавторами среди прочего в обширную публикацию по экспериментальному выявлению «эффекта свидетеля» для ряда клеток и животных [AM39].

Рисунок 2.9.2. РИНГ по отсроченной клоногенной гибели (15-я генерация) в иммортализованных кератиноцитах человека (клетках HPV-16) после воздействия γ-излучения. Представлены рассчитанные авторами исходя из непосредственных экспериментов вклады в РИНГ прямого действия облучения и непрямого, в виде «эффекта свидетеля» [AS23].

Практически единственные в своем роде публикации К. Мазерсилл и К. Сеймура за 2000 г. [AS23], где оказалась выявлена РИНГ при наималейших дозах радиации (как при непосредственном облучении, так и в результате «эффекта свидетеля»), стала классической в области мировой радиобиологии и приводится почти во всех последних документах и обзорах, посвященных различных аспектам малых доз радиации — во всех вариантах Сообщения НКДАР по немишенным эффектам излучения (2004–2009) [AU17, AU18], в BEIR-VII [AB10], в МКРЗ-99 [AI7][125] и в других публикациях (к примеру — [AW25]).

Но нельзя считать данные [AM39, AM46, AS23] основанием для подкрепления тезиса об индукции РИНГ малыми дозами радиации с низкой ЛПЭ по ряду следующих причин:

1) HPV-G клетки человека a priori не могут считаться абсолютно нормальной клеточной моделью вследствие их иммортализации вирусом (см. выше подраздел 2.6.3 «Аномалии клеточных систем in vitro»).

2) Некоторые линии этих клеток проявляют в диапазоне малых доз аномальную радиочувствительность, определяемую не только как отсроченная гибель, но и как обычная выживаемость. Для доз 0,01–0,05 Гр в работе [AS23] клоногенная выживаемость уменьшалась на 34–38%. Это аномально высокий уровень гибели клеток для подобных доз. Такая гиперчувствительность в диапазоне малых доз, насколько мы знаем, не обнаружена для клеток даже исследователями феномена гиперрадиочувствительности M.C. Joiner и B. Marples [AJ6, AJ7, AM7, AM25]. Хотя, конечно, мы знакомы не со всеми публикациями этих авторов и на этом пункте не настаиваем.

3) Радиочувствительность HPV-G кератиноцитов человека в разных опытах нестабильна и сильно варьирует. Например, если в работе 2000 г. [AS23] дозы 0,01; 0,03 и 0,05 Гр прямого облучения вызывали снижение клоногенной выживаемости на 34–38%, то в работе 2002 г. [AM46] для этих же клеток и этого же параметра описано снижение на 2–7% для доз 0,01 и 0,05 Гр. Но мы видим, что наиболее отчетливо эффекты РИНГ для доз 0,01–0,1 Гр показаны именно в работе [AS23].

К. Сеймур и К. Мазерсилл никак не объясняют в статье 2002 г. [AM46], почему исследуемая ими линия клеток вдруг настолько повысила свою радиорезистентность за два года. Я долго пытался найти что-либо по данному поводу в оригиналах их публикаций, сравнивал методики [AM46] и [AS23], но никаких кардинальных отличий так и не смог обнаружить.

Поэтому на рис. 2.9.3 мы позволили себе просто представить аутентичные фрагменты из двух указанных публикаций [AM46, AS23].

4) Возможность артефактов. Снижение клоногенной выживаемости необлученных клеток при помещении в среду от облученных может быть связано не только с воздействием радиационного фактора. Вполне вероятно наличие неконтролируемых эффектов флуктуаций среды. Например, в работе [AM22] показано, что при одних и тех же дозах облучения клеток их отсроченная гибель и неопластическая трансформация зависит от типа инкубационной сыворотки. Более того, обнаружено увеличение числа клеток, подвергавшихся трансформации, для некоторых партий сыворотки по сравнению с другими. Изменения коррелировали с увеличением отсроченной гибели потомков облученных клеток. Авторы [AM22] заключают, что обнаруженные ими эффекты, связанные со средой, могут быть ошибочно приписаны повышению нестабильности генома в постлучевой период при росте клеток в присутствии некоторых партий сывороток.

По-видимому, при отборе среды от облученных клеток трудно соблюсти все необходимые условия для соответствующего контроля. Возможно, играет роль локальное повышение температуры среды во время облучения и т.п. В частности, К. Сеймур и К. Мазерсилл [AM39, AM46, AS23] облучали HPV-G кератиноциты человека при комнатной температуре, и хотя контрольные клетки подвергались ложному облучению помещением на столик облучателя, однако ясно, что без лучевого воздействия температурные микрофлуктуации отсутствуют.

Не вызывает никаких сомнений реальность «эффекта свидетеля», когда индуцируются каскады сигналов от клетки к клетке [AM49], и эти сигналы передаются средой, однако не кажется однозначной связь этого эффекта при малых дозах радиации исключительно с радиационным фактором.

Рисунок 2.9.3. Представленный в аутентичном виде материал по клоногенной выживаемости облученных клеток HPV-G из статей К. Сеймура и К. Мазерсилл от 2000 г. [AS23] и от 2002 г. [AM46]. Ср. обозначенные в примечаниях к левой таблице значения для эффективности посева (platting efficiency) в контроле со значениями в скобках на правой таблице; видна практическая идентичность. Тем не менее, кривые клоногенной выживаемости после облучения в публикациях 2000 и 2002 гг. отличаются кардинально, в том числе в диапазоне малых доз.

5) Для индукции РИНГ как «эффекта свидетеля» практически во всех остальных исследованиях (за исключением рассмотренных выше клеток TK6 [AM28], которые тоже имеют аномалии) минимальные дозы составляли не менее 0,5–1,0 Гр (см. выше табл. 2.6.1).

6) РИНГ как «эффект свидетеля» индуцируется не для всех линий клеток. В работах [AM47, AS21] не было обнаружено РИНГ для нормальных фибробластов человека ни при прямом облучении, ни посредством «эффекта свидетеля», но РИНГ экспрессировалась для радиочувствительной SW48 линии клеток карциномы кишечника (дозы облучения 0,5 and 1,0 Гр). Индукция РИНГ как «эффекта свидетеля» через среду отсутствовала для нормальной линии GM10115 гибридных клеток человека и хомячка, облученных в широком диапазоне доз (1–10 Гр), причем для широкого диапазона клеточных концентраций [AN3].

7) Не совсем ясно, насколько однозначно подавление клоногенной выживаемости клеток через среду от облученных клеток (как «эффект свидетеля») связано со стабильностью генома. Соответствующие данные кажутся противоречивыми. Эффект экспрессировался для радиочувствительных SW48 клеток, но не экспрессировался для фибробластов [AM47, AS21]. Эффект экспрессировался для нестабильных линий GM10115 клеток, но не экспрессировался для стабильных [AN3]. Однако для среды от облученных клеток уротелия мышей линии CBA/H, для которых характерны повышенная индукция радиогенных раков и нестабильность хромосом, показана меньшая степень подавления клоногенной выживаемости клеток кератиноцитов человека HPV-G в модельной системе, чем для более стабильной линии мышей C57/BL6 [AM39].

Среда от облученных клеток уротелия курильщиков менее подавляла клоногенную выживаемость клеток HPV-G, чем среда от облученных клеток некурящих людей. Имелись отличия и для клеток, взятых из тканей мужчин и женщин [AM39]. Для облученных культур опухолевых тканей эффект был более выражен, чем для нормальных тканей [AM39].

В результате К. Сеймур и К. Мазерсилл [AM39, AS23] весьма осторожно интерпретируют полученные ими данные о подавлении роста необлученных клеток через среду от облученных с позиции «вред — польза». Они указывают, что клеточная гибель при малых дозах радиации — это вообще не проблема, поскольку затрагивается столь малая фракция клеток, что никакого риска для клеточных функций нет (“The death response at low doses is not a problem since it involves too few cells to compromise tissue function”). В [AM39, AS23] обсуждается гипотеза, что гибель клеток после непосредственного («прямого») облучения в малых дозах является защитным механизмом, и что таким образом элиминируются клетки с повреждениями. Отмечается также, что защитный механизм, медиируемый как «эффект свидетеля», в целом выгоден для популяции [AM39, AS23].

На наш взгляд, исследования «эффекта свидетеля» для облучения с низкой ЛПЭ имеют большое значение для фундаментальной молекулярной и клеточной радиобиологии, расширяя наши представления о механизмах клеточного взаимодействия и об интегральности тканевых систем. Но в практическом плане трудно сказать, насколько этот эффект может быть важен. Действительно, согласно расчетам [AP28] при дозах рентгеновского излучения около 0,005 Гр пораженными оказываются до 85% клеточных мишеней и немишенными эффектами, понятно, можно пренебречь. Кроме того, мы имеем микродозиметрическую модель определения величины малых доз с биофизических позиций, которая первоначально была предложена в основополагающих фундаментальных работах [AB22, AF8], а позже включена в сообщения НКДАР. Эта модель основывается на требовании для большинства пораженных клеток не более чем одного радиационного события (см. выше раздел 1.2). Рассчитанная величина малой дозы для рентгеновского излучения, когда поражены только около 22% клеточных мишеней (но не более 2% из них претерпели более одного радиационного события) составляет 0,0002 Гр. Дальнейшие расчеты в сообщении НКДАР 2000 [AU13] демонстрируют нам, что при дозе 0,005 Гр рентгеновского излучения пораженными оказываются более 99% клеточных мишеней (см. выше раздел 1.2 и табл. 1.2.1). Получается, что для доз излучения с низкой ЛПЭ порядка 0,005 Гр и свыше говорить о каком-либо значимом «эффекте свидетеля» просто нет смысла.

Надо согласиться, что исследования «эффект свидетеля» для радиации с низкой ЛПЭ имеют некое значение в области радиотерапии опухолей [AM46, AM39]. Но сомнительно, что эти данные можно интерпретировать с позиций повреждающего эффекта облучения и учесть при составлении НРБ. Что уж говорить, впрочем, — совсем не сомнительно; наш ответ — отрицателен.

В настоящей монографии, точнее в ее Книге первой, мы не смогли подробно проанализировать все моменты радиационного «эффекта свидетеля», хотя нами и накоплен достаточно обширный соответствующий материал. Объем книги даже при изложении всего двух тем по малым дозам из порядка восьми задуманных получился слишком большим. Поэтому мы надеемся рассмотреть «эффект свидетеля»(вкупе с другими аспектами радиационного воздействия в малых дозах) позже.

Здесь же повторим только, что и для «эффекта свидетеля» применительно к малым дозам рентгеновского или γ-излучения мы не имеем фактов индукции дозами до 0,1–0,2 Гр кроме все тех же единичных исключений, которые сводятся к нестабильным, аномальным либо к дефектным клеткам (таким, как лимфобластоидная линия TK6 [AM28] и кератиноциты HPV-G [AM39, AM46, AS23]. В большинстве случаев при передаче через инкубационную среду «эффект свидетеля» индуцируется при дозах минимум 0,5 Гр (отчасти см. в табл. 2.6.1 выше; аналогичные зависимости имеют место не только для РИНГ, но и для других конечных показателей эффекта). Есть, правда, отдельные факты дистанционного повреждения клеток малыми дозами радиации подобной природы при использовании специальной техники микропучка. В этих опытах применяется ультрамягкое Х-излучение, сфокусированное в специальной диффракционной линзе с помощью микроскопа (удается поразить мишени размером менее 250 нм) [AS12, AF22]. Однако в цитированных работах конечные показатели эффекта не имели отношения к РИНГ.

Возвращаясь к вопросу об «исключениях», мы должны абстрагироваться от дискуссионного отступления, касающегося «эффекта свидетеля». Как мы видели выше, некоторые особенности HPV-G кератиноцитов человека, в частности их, скажем так, «нестабильная сверхрадиочувствительность» (см. рис. 2.9.3), не позволяют делать глобальные заключения на основе опытов с этими клетками.

Аномально радиочувствительная и, видимо, нестабильная линия HPV-G является хорошей экспериментальной моделью для изучения как РИНГ, так и «эффекта свидетеля». Неудивительно, что в 2005 г. группой К. Мазерсилл было обнаружено повышение частоты мутаций в мтДНК необлученных клеток, помещенных в среду от клеток, облученных в дозах начиная с 5 мГр [AM59].

Дата добавления: 2015-07-20