Реактивы для микрохимических реакций и красители

Микрохимические реакции производят с целью установ­ления подлинности лекарственного сырья. Они очень разно­образны. С помощью микрохимических реакций устанавли­вается наличие в лекарственном сырье действующих ве­ществ и нередко их локализация в тканях (алкалоиды, гликозиды, дубильные вещества, жирные, эфирные масла, слизь и др.); с другой стороны, при помощи микрохимических реакций определяют различные части клетки, характер оболочки, содержимое клеточного сока, различные включе­ния. Микрохимические реакции можно производить со срезами, по­рошком, мацерированным материалом на предметном или часовом стекле, иногда в закрытой чашечке, бюксе(если применяются кон­центрированные кислоты).

С целью установления природы клеточной оболочки ча­сто используют реактивы па целлюлозу и на одревеснение.

Реактивы на целлюлозу. Xлор - цинк - иод. Очень эффективный и чувствительный реактив, однако, требует тщательного приготовления. Существует много модифика­ций и рецептов изготовления, дающих надежные результа­ты. Часто используется следующий рецепт: 20 г хло­ристого цинка растворяют в 8,5 мл воды, к раствору при­бавляют по каплям раствор йода в йодиде калия (3 г KJ; 1,5 г,J₂; 60 мл воды) при постоянном взбалтывании, до по­явления осадка йода, т. е. до насыщения. Обыкновенно бы­вает достаточно прибавить 1,5 мл указанного раствора. Мо­гут быть использованы и другие прописи. Хорошо приготов­ленный реактив можно использовать в точение нескольких лет, если хранить его в темной склянке с притертой проб­кой, оберегая от действия света. При работе реактив доста­ют из склянки посредством стеклянной палочки, не затрагивая осадка. Реактив окрашивает клетчатку в сине-фиоле­товый цвет. Однако окрашивание часто маскируется частич­ным одревеснением оболочки, содержанием кутиноподобных веществ, пигментов и прочих веществ, часто присутствую­щих в клетке.

Йод с серной кислотой. Реактив окрашивает цел­люлозу в синий цвет. Окраска яснее и интенсивнее, когда в клеточной оболочке больше целлюлозы и меньше других компонентов (лигнина, кутиноподобных веществ и др.). Про­изводят окраску следующим образом. Препарат пропиты­вают 1 % раствором йода в йодиде калия, затем под покров­ным стеклом воздействуют серной кислотой (7 весовых ча­стей 95% серной кислоты па 3 части воды). Или препарат сначала помещают в раствор йода (металлического йода 0,3 г, йодида калия 1,3 г, воды 100 мл) затем обрабатывают серной кислотой (серная кислоты 2 части, воды 1 часть) под покровным стеклом.

Раствор Люголя. Реактив готовят следующим об­разом: 0,5 г йода и 1 г йодида калия растворяют в неболь­шом количестве воды и разбавляют водой до 100 мл. Перед употреблением раствор разбавляют водой в отношении 1: 4. Сохраняют в защищенном от света месте. Реактив окраши­вает клетчатку в желтый цвет.

Проба на растворение целлюлозы. Целлю­лоза составляет основу клеточной оболочки. Она отличается высокой устойчивостью и нерастворимостью в самых разно­образных реактивах. Лишь свежеприготовленный раствор аммиачной окиси меди, так называемый реактив Швейцера, является единственным, известным для целлюлозы раство­рителем. Раствор готовят следующим образом: 2°/о раствор сернокислой меди обрабатывают соответственным количест­вом едкого натра или едкого кали. Выпавший осадок гид­рата окиси меди отмывают насколько возможно от остат­ков соли; из него удаляют воду путем отжимания и затем растворяют в крепком водном растворе аммиака. Вместо ед­кого кали для осаждения можно использовать и 25 % рас­твор аммиака. Реактив Швейцера хранят в совершенно пол­ной, герметически закупоренной склянке в темном месте. Реакцию можно проводить под покровным стеклом. Однако если в клетке имеется много опробковевших или кутинизированных слоев, то нужна более продолжительная обработ­ка в закрытой чашечке. Клетчатка растворяется в реактиве после медленного разбухания, кутикула остается нерастворенной.

Реактивы на одревесневшие оболочки. Микрохимические реакции на одревеснение довольно многочисленны и разно­образны. Наиболее употребительны следующие.

Флороглюцин с соляной кислотой. Относит­ся к наилучшим реактивам для установления одревеснения. Препарат пропитывают 5 — 10% спиртовым раствором флороглюцина, а затем добавляют 1—2 капли концентриро­ванной соляной кислоты пли 25% раствор серной кислоты. Одревесневшие оболочки принимают яркую вишневую ок­раску, интенсивность которой зависит от степени одревес­нения. Реакция очень чувствительна, однако не стойкая; от воды и нагревания исчезает. Срезы после окрашивания можно перенести в глицерин.

Сульфат анилина. Из многочисленных модифика­ций рецептов реактива наиболее удобен принятый ГФ1Х (стр. 773): 5 частей сульфата анилина растворяют в 40 мл дистиллированной воды и 50 мл 50° спирта и разбавляют водой до 100 мл. Одревесневшие оболочки от реактива при­нимают ярко-желтую окраску. Прибавление к реактиву сер­ной кислоты усиливает окраску, которая очень устойчива. Аналогично действует солянокислый анилин.

Сафранин. Один из самых распространенных красителей па одревесневшие оболочки. Применяется в виде 0,5—1% раствора в 50° этиловом спирте. Реактив хранится в склянке с притертой пробкой. Препарат помещают в краску на пол­часа, затем промывают водой, переносят в 96° спирт для отмывания излишней краски и быстро промывают кислым спиртом (на 100 мл 96° спирта добавляют 2 капли соляной кислоты), который извлекает краску из всех тканей, кроме одревесневших. Препарат переносят в глицерин. Окраска одревесневших оболочек от сафранина розовая до малиново-красной. Интенсивность окраски зависит от степени одре­веснения.

Паранитроанилиы. 1 % водный раствор паранитроанилинабыстро окрашивает одревесневшие ткани в оран­жевый цвет. После окраски объекты помещают в глицерин.

Реакции на опробковевтие и кутинизированные оболоч­ки. Xлор-цинк-йод.Реактив окрашивает пробку и кутикулу в желтый цвет до коричневого. Эта реакция, од­нако, не специфична, так как частично этим реактивом ок­рашиваются одревесневшие и ослизневшие оболочки.

Раствор Судана III (состав реактива см. раздел «Реакции на жиры). Окрашивает опробковевшие и кутини­зированные оболочки в оранжево-желтый цвет.

Реакции на крахмал. Крахмал в объектах следует на­блюдать в воде или сильно разбавленном глицерине, без на­гревания. Он находится в виде зерен различной формы и величины, характерных для каждого вида сырья; иногда крахмал находится в видеклейстера (например, в клубнях салепа), что зависит от способа заготовки сырья.

Единственной и вместе с тем классической реакцией на крахмал является йодная реакция. Для этой реакции можно применять раствор йода в спирте (если объект содержит значительное количество влаги), или в водном растворе йодида калия. Во всех случаях следует избегать больших концентраций йода.

Раствор йода (раствор Люголя). Приготовле­ние раствора см. раздел «Реактивы на целлюлозу». Крах­мальные зерна окрашиваются йодом в синий цвет, крах­мальный клейстер — в красновато-фиолетовый. Йодная реакция очень яркая, чувствительная, однако нестойкая, вследствие чего в постоянных препаратах се сохранить не удастся.

Реакции на инулин. Инулин можно видеть в препаратах (в глицерине или в концентрированном растворе хлоралгид­рата) в виде бесформенных, бесцветных, стекловидных глыбок, комков (смотреть без нагревания!). В свежих объектах, выдержанных в течение недели и более в 70° спирте или в глицерине, инулин имеет вид хорошо сформированных округлых сферокристаллов, обычно прилегающих кклеточ­ным стенкам. Дополнительная обработка спиртом усиливает формирование сферокристаллов; они имеют лучистое ра­диальное строение и концентрическую слоистость. Наличие инулина в лекарственном сырье можно обнаружить некото­рыми микрохимическими реакциями.

Спиртовой (15—20%) раствор α-нафтола или тимола (реактив Молиша). Препарат помещают в один изуказанных реактивов, затем под края покровного стекла вводят 1—2 капли концентрированной серной кис­лоты; появляется розово-фиолетовое окрашивание (α-нафтол) или карминово-красное (тимол). Присутствие в срезе воды вызывает выпадение осадка, поэтому срезы лучше предварительно обсушить (можно полоской фильтровальной бумаги или осторожно подогреть на горелке). Указанные реактивы па полисахариды дают соответствующую реакцию и с крахмалом, поэтому при испытании на инулин всегда следует исключить присутствие крахмала по реакции с йодом.

Реакции на жиры. Для открытия жиров в лекарствен­ном сырье пользуются различными красителями. Однако эти красители совершенно так же окрашивают эфирные масла, смолы, кутинизированные оболочки, содержимое млечников. Поэтому при исследовании лекарственного сырья па содер­жание жиров необходимо установить их локализацию и про­вести другие пробы.

Судан III окрашивает капли жирного масла в оранже­во-красный цвет. Реактив состоит из 0,01 г анилиновой кра­ски Судан Ш, 5 г спирта и 5 г глицерина. Срезы помещают на несколько часов в реактив, затем промывают в 50^е спир­те и переносят в глицерин. Для ускорения реакции препарат в Судане III можно нагреть, после чего вместо испаривше­гося реактива добавить под покровное стекло глицерин.

Алканин. Применяется спиртовой раствор корневищ алканы, который окрашивает жиры в розовый или вишнево-красныйцвет. Состав реактива: 0,5 г порошка корневищ алканы растворяют при нагревании в 20 мл 20% уксусной кислоты, добавляют 50 мл 50° спирта и фильтруют. При работе реактив разбавляют равным объемомводы. Срезы помещают в реактив на определенное время (10—12 часов), после чего промывают 50° спиртом и заключают в гли­церин.

Шарлаховый красный употребляется в виде на­сыщенного раствора в 70^е спирте. Окрашивает жиры в крас­ный цвет.

Омыление по Розенталеру. Срезы помещают в 15% раствор едкой щелочи и слегка подогревают. Через некоторое время выделяются кристаллы жирнокислых солей в виде отдельных игл или пучков, что хорошо видно под микроскопом. Эта реакция дает возможность отличить жиры от эфирных масел, смол.

Реакции на эфирные масла, смолы, содержимое млечни­ков. Все реактивы, используемые для открытия жиров, дают реакции с указанными веществами.

Цветные реакции на смолы те же, что и на жиры, и на каучук. Для обнаружения смол можно воспользоваться спе­цифической реакцией. Концентрированный водный раствор уксуснокислой меди окрашивает смолы в изумрудно-зеле­ный цвет. Кусочки материала помещают в раствор от 5 дней до месяца, затем промывают в проточной воде и просмат­ривают в глицерине.

Реакции на слизь. Слизь сильно преломляет свет, в воде разбухает и растворяется; в смеси спирта с глицерином представляется в виде стекловидной массы; в растворе хло­ралгидрата постепенно становится слоистой; в спирте жел­теет и становится слоистой.

Реакции с окрашиванием. Для окрашивания сли­зи применяют ряд реактивов. Срезы помещают на 5—10 ми­нут в концентрированный раствор сернокислой меди, затем прополаскивают в воде и наносят 1—2 капли 50% раствора едкого кали. Слизь окрашивается в голубой цвет (растения сем. мальвовых, орхидных) или в зеленый (морской лук).

Метиленовый синий. Спиртовой раствор реактива (1: 5000) окрашивает слизь в голубой цвет. Можно исполь­зовать аналогичный раствор метиленового зеленого.

Водный раствор едкой щелочи (3—5 %) окра­шивает слизь в лимонно-желтый цвет. Такую же реакцию дает раствор аммиака.

Реакция с тушью. Смесь туши и воды (продаж­ную, жидкую черную тушь разводят водой 1: 10; реактив приготовляют по мере надобности). Исследуемое сырье из­мельчают в порошок и помещают па покровное стекло в каплю туши, тщательно размешивают иголкой, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. В по­ле зрения на темно-сером фоне выделяются белыми ост­ровками клетки со слизью, так как тушь в слизь не прони­кает. Эти клетки постепенно разбухают и растекаются бла­годаря растворению слизи в воде.

Реакция двойного окрашивания. Срез иссле­дуемого объекта помещают на 20 минут в раствор хлорида окисного железа, затем переносят на короткое время в рас­твор метиленового синего, промывают водой и заключают в глицерин. При этом клетки со слизью окрашиваются в желтый цвет; механические волокна - в голубой; сосуды древесины - в зеленый.

Реакции на алкалоиды. Микрохимические реакции на алкалоиды проводятся с использованием реактивов, осаж­дающих эти соединения. На предметное стекло берут поро­шок или мелкий соскоб, добавляют 2—3 капли 5% раствора уксусной кислоты, закрывают покровным стеклом. Через 2—3 минуты накладывают рядом другое покровное стекло, под которое засасывается жидкость, и убирают первое по­кровное стекло вместе с порошком. На некотором расстоя­нии от покровного стекла наносят каплю реактива на алка­лоиды (Вагнера, Майера, Драгендорфа или др.) и осторожно палочкой соединяют каплю с уксуснокислым извлечением, находящимся под стеклом. По мере поступления реактива под стекло на границе жидкостей постепенно образуется мутная зона (смотреть па черном фоне без микро­скопа).

Из микрохимических реакций на алкалоиды сравнитель­но хорошо воспроизводимой является реакция с йод-калия йодидом на алкалоиды атропин (гиосциамин), скополамин (в следующем сырье: лист белладонны, белены, дурмана обыкновенного, корень белладонны). Срезы из свежих частей растений просматривают в указанном реактиве; в клетках, содержащих алкалоиды, виден коричневый осадок, через не­которое время выпадают звездчатые кристаллы с металличе­ским оттенком.

Присутствие алкалоидов в свежем млечном соке мака снотворного можно обнаружить в виде многочисленных бес­цветных призматических или звездчатых кристаллов, при действии концентрированной серной или разбавленной со­ляной кислоты.

Микрохимические реакции на алкалоиды в лекарствен­ном сырье рекомендуетсяпроводить со свежими растениями или с только что заготовленным сырьем. При микрохимиче­ском исследовании на алкалоиды совершенно обязательно проведение контрольных реакций, так как алкалоидные ре­активы реагируют по только с алкалоидами, но также и с некоторыми другими веществами (белки, частично гликозиды и углеводы). Обычно проводят контрольные - реакции после удаления алкалоидов из сырья. Для этой цели поль­зуются смесью винной кислоты и спирта (1:20), извлекая алкалоиды из сырья. Продолжительность обработки зависит от материала; иногда довольно продолжительная (неделю и больше).

Извлечение алкалоидов ведется в закрытых склянках, бюксах при частом взбалтывании. Обработанные таким об­разом срезы могут служить в качестве контрольных.

Реакции па гликозиды. Наличие гликозидов в сырье оп­ределяют методами гидролиза, с помощью цветных реак­ций, реакций осаждения, биологическими реакциями. Выявление гликозидов непосредственно в клетках расте­ния сопряжено с большими трудностями и для многих групп гликозидов микрохимические реакции не разработаны. Они имеются лишь для некоторых гликозидов.

Антрагликозиды. В лекарственном сырье антрагликозиды можно обнаружить под микроскопом при помощи реакции с водным раствором (3—5%) едкой щелочи. Ткани, содержащие антрагликозиды, окрашиваются в вишнево-красный цвет. Реакцию можно проводить на срезах или с порошком.

Антрагликозиды в лекарственном сырье легко открыва­ются также методом микросублимации. На предметное стек­ло берут порошок или грубый соскоб и помещают на асбес­товую сетку; над стеклом на расстоянии 3 мм помещают другое предметное стекло. Подставляют под сетку горелку так, чтобы пламя не доходило до сетки на 4 см. Антрагли­козиды возгоняются в виде паров желтого цвета и минут через 5 на верхнем (холодном) предметном стекле они оса­ждаются в виде мелких, желтых кристаллов, которые со ще­лочью дают кроваво-красное окрашивание. Реакцию микро-сублимации можнопровести в пробирке, которая с неболь­шим количеством порошка или грубого соскоба нагревается в горизонтальном положении (нагревать следует только дно пробирки). На холодных стенках пробирки будут конден­сироваться антрагликозиды.

Арбутин. Разбавленная азотная кислота окрашивает клетки, содержащие арбутин, от темно-оранжевого до тем­но-красно-бурого цвета. Окраска появляется сразу и быстро переходит в светло-желтую. Наличие хлорофилла в тканях маскирует окраску. Хорошие результаты дает также метод микросублимации. Сам арбутин плохо сублимируется, но его агликон — гидрохинон легко возгоняется. Исследуемое сырье измельчают, и порошок помещают на предметное стек­ло в каплю соляной кислоты (1: 10), хорошо перемешивают и оставляют в покое на несколько минут. Происходит гид­ролиз арбутина. Затем стекло переносят на асбестовую сот­ку и дальнейшую процедуру проводят так же, как при микросублимации антрагликозидов. Гидрохинон возгоняется и осаждается в виде кристаллов — мелких моноклинических листочков и призм, крестообразных сростков и в виде «ел­ки». При действии слабого раствора хлорного железа крис­таллы растворяются, образуя черную окраску. От аммиака они (сразу или в течение одного часа) дают красновато-бу­рую окраску.

Гесперидин. Путем осаждения абсолютным спиртом можно получить кристаллы гесперидина и наблюдать их не­посредственно в клетках в виде иголочек или сферокристаллов.

Гесперидин можно обнаружить при действии аммиака, разбавленных щелочей, в которых он легко растворяется с образованием желтого окрашивания.

Подобный результат получается при действии серной кислотой. Реакцию можно проводить на срезах, просматри­вая их в указанных реактивах.

Реакции на сапонины. Микрохимические реакции для обнаружения сапонинов в тканях растения не всегда досто­верны. Срезы нагревают в смеси спирта и концентрирован­ной серной кислоты (равные объемы), добавляют одну кап­лю концентрированного раствора железа закисного сульфа­та. В клетках, содержащих сапонины, образуется окраши­вание вначале желтое, затем красное, переходящее в фио­летово-голубое (реакция Лафона). Из биологических мето­дов используют метод, предложенный Деляторской, основан­ный на гемолитических свойствах сапонинов. Названный ав­тором метод «кровяной желатины заключается в следую­щем: приготовляют 6—8% раствор желатина на физиоло­гическом растворе хлорида натрия. К 2—3 мл этого рас­твора прибавляют 2—3 капли дефибринированной крови; желатин застывает, и его режут на кусочки. Из подготов­ленного сырья делают срез, на него кладут кусочек кровя­ной желатины, покрывают покровным стеклом, придавли­вают и оставляют на некоторое время. Если в растении есть сапонины, то содержащиеся в желатине эритроциты начнут растворяться и вокруг среза образуется круглая, прозрачная зона — «гемолитический дворик».

Реакции па дубильные вещества. Водные (2—5%) рас­творы солей окисного железа (хлорид, сульфат, железоаммонийные квасцы) являются очень хорошими реактивами на дубильные вещества и вполне применимы для микрохи­мических реакций. Ткани, содержащие дубильные вещества, окрашиваются от указанных реактивов в сине-черный или зеленовато-черный цвет. Оттенки окраски мало заметны, так как присутствующие в клетке растительные кислоты (на­пример, лимонная) могут видоизменять окраску (синюю пе­реводить в зеленую).

Довольно часто применяется реакция с бихроматом ка­лия, позволяющая установить локализацию дубильных ве­ществ в тканях. Для этого пользуются раствором бихромата калия 1: 10, помещая в него материал на несколько дней. В клетках, содержащих дубильные вещества, выпадает плот­ный серо- или красно-бурый хлопьевидный или зернистый осадок. Красно-бурый цвет появляется иногда лишь спустя некоторое время.

Для обнаружения дубильных веществ применяют также концентрированный раствор молибденовокислого аммония в концентрированном растворе хлорида аммония (реакция Гардинера или Висселинга), 25% раствор хлористого аммония— 1 часть, 50% раствор молибденовокислого аммония — 1 часть, вода — 1 часть. Под действием этого реактива в клетках, содержащих дубильные вещества, выпадает желтый осадок; с танином реактив дает красный осадок. Проникно­вение реактива в ткани ускоряется при подщелачивании раствора (добавлением аммиака). Реакция довольно чув­ствительная и эффективная, однако ее недостатком является легкая растворимость осадка в воде и разбавленных кисло­тах, а также слабая устойчивость реактива при хранении.

Дата добавления: 2015-07-18