Метилирование ДНК: биохимия

2.1 Ацетилирование гистонов

Ацетилирование гистонов играет важную роль в модуляции структуры хроматина при активации транскрипции, увеличивая доступность хроматина для транскрипционного аппарата.

Известно, что ацетилированные гистоны признак транскрипционно активного хроматина. Но является ли ацетилирование причиной или следствием активации транскрипции? Сейчас более склонны думать, что это одна из причин. Гистоны целенаправленно модифицируются на тех промоторах, которые требуется активировать. При этом определенные остатки лизинов подвергаются ацетилированиям и деацетилированиям с помощью ферментов ацетилтрансфераз и деацетилаз. Полагают, что ацетилированные гистоны менее прочно связаны с ДНК и поэтому транскрипционной машине легче преодолевать сопротивление упаковки хроматина. В частности ацетилирование может облегчать доступ и связывание факторов транскрипции к их элементам узнавания на ДНК. Сейчас идентифицированы ферменты, которые осуществляют процесс ацетилирования и деацетилирования гистонов.

В дрожжах с процессами ацетилирования гистонов связан сложный ацетилтрансферазный комплекс SAGA. В него входит более 20 различных белков, в том числе и гистоноподобные TAF.

Уровень ацетилирования необходимый для облегчения транскрипции низок. 12 ацетилированных лизинов на гистоновый октамер усиливает транскрипцию хроматина in vitro на порядок. Помимо ослабления структуры хроматина, ацетилирование, возможно облегчает взаимодействие ацетилированных нуклеосом с другими факторами, участвующими в ремоделировании хроматина или с компонентами транскрипционного аппарата.

Таким образом осуществляется комбинаторный эффект: с одной стороны ацетилирование-деацетилирование прямо влияет на структурную подвижность хроматина, а сдругой стороны оно влияет на белок-белковые взаимодействия разных факторов с белками хроматина.

Ацетилирование остатков лизина в N-концевых "хвостиках" гистонов H2A, H2B, HЗ и H4 нейтрализует их положительный заряд и соответственно блокирует ассоциацию с витками нуклеосомной ДНК. Это, в свою очередь, декомпактизует структуру как самой нуклеосомы, так и хроматина в целом и, кроме того, освобождает внешнюю поверхность витков ДНК для взаимодействий с регуляторными факторами. Степень ацетилирования гистонов определяется активностью двух типов ферментов - гистонацетилтрансфераз HAT, и деацетилаз HDAC. Ряд активаторов и коактиваторов транскрипции (в частности, такой важный, как CBP/300, участвующий в регуляции клеточного роста, дифференцировки, репарации ДНК и апоптоза), а также некоторые субъединицы базального аппарата транскрипции (ТАF11250) обладают гистонацетилтрансферазной активностью. Напротив, репрессоры транскрипции (такие, как Mad и ядерные рецепторы) ассоциированы с деацетилазной активностью. В регуляцию транскрипции вовлекается также и ковалентная модификация ДНК. И эти две модификации белков и ДНК тесно переплетаются.

2.2 ДНК-метилтрансферазы

У высших эукариот метилирование остатков цитозина в положении 5 с образованием 5- метилцитозина катализируется ферментами ((цитозин-5)-ДНК-метилтрансферазами), которые обнаружены у прокариот и эукариот. Каталитический механизм действия этих ферментов изучен на примере бактериальной метилазы M.HhaI, которая модифицирует соответствующий сайт рестрикции. С помощью рентгеноструктурного анализа показано, что после взаимодействия Мтазы со специфическим участком ДНК остаток модифицируемого цитозина выпячивается из двойной спирали и образует ковалентную связь с полипептидной цепью фермента в положении С6. В этом промежуточном комплексе активированный атом углерода С5 акцептирует метильную группу S-аденозилметионина, выступающего в качестве кофактора.

Полипептидные цепи Мтаз эукариот содержат на своих N-концах большой домен, который обеспечивает ядерную локализацию ферментов, их доставку к репликативным вилкам, ответ ферментов на регуляторные воздействия.

Большинство прокариотических Мтаз способны метилировать ДНК de novo, распознавая неметилированные палиндромные гексануклеотидные последовательности. Они также метилируют последовательности, в которых одна цепь ДНК уже содержит метильные группы. В отличие от этого эукариотические Мтазы относятся к "поддерживающим" ферментам, которые узнают и метилируют только наполовину метилированные последовательности, формирующиеся во время репликации ДНК, когда вновь синтезированная цепь неметилирована. У млекопитающих остатки С метилируются преимущественно в составе динуклеотидов CpG, однако в последнее время описаны случаи метилирования и последовательностей CpNpG. В геноме позвоночных животных метилировано около 70% динуклеотидов CpG и около 6-7% всех остатков цитозина.

"Поддерживающие" Мтазы животных обладают небольшой способностью осуществлять метилирование ДНК и de novo в полностью неметилированных участках, а также искусственных субстратов (олигонуклеотидов), содержащих ошибочно спаренные основания. Остается непонятным, является ли указанное свойство Мтаз достаточным для осуществления метилирования de novo обширных участков генома в эмбриогенезе или же этот процесс происходит с участием других ферментов. Известно, что гомозиготные делеции в гене Мтазы у мышей вызывают гибель зародышей в раннем эмбриогенезе, что указывает на важную роль метилирования ДНК в онтогенезе млекопитающих. Однако даже у таких мутантных эмбрионов небольшая часть последовательностей ДНК метилирована. Метилирование остатков цитозина оказывает влияние на структурные характеристики ДНК. Это проявляется в облегчении перехода метилированных участков ДНК из B-формы в Z-форму, увеличении шага спирали ДНК и изменении кинетики образования крестообразных структур. Метильная группа 5-mC выступает на поверхности большой бороздки ДНК, находящейся в B-форме, и увеличивает ее гидрофобность, что в ряде случаев является решающим фактором при взаимодействии белков с соответствующими участками ДНК. В настоящее время у млекопитающих известны четыре ДНК-метилтрансферазы: Dnmtl, Dnmt2, Dnmt3a и Dnmt3b. Относительно природы ДНК-метилтрансферазы, осуществляющей метилирование de novo, существуют разные мнения. Возможно, это кодируемая геном DNMT1 ДНК-метилтрансфераза 1, ответственная за превалирующую в клетках млекопитающих метилтрансферазную активность и за поддерживающее метилирование (см. Рис.1).

Рис.1. Профиль метилирования по длине гена. Стрелка показывает направление транскрипции гена, перечёркнутая крестиком стрелка указывает на инактивацию метилированного гена. Красные кружки обозначают цитозин, синие – 5-метил-цитозин. Жёлтыми прямоугольниками обозначены экзоны гена, зелёными – интроны [1].

2.3 Необходимость метилирования ДНК у эукариот

О важной роли метилирования свидетельствует, что гомозиготная делеция Dnmt1 у мышей ведет к летальному исходу на эмбриональной стадии развития. Это наблюдение явилось решающим доказательством необходимости метилирования ДНК у высших эукариот. На этой же модели получены доказательства давно предполагавшейся связи между метилированием ДНК и блокированием экспрессии метилированных генов.

Другим доказательством связи блока транскрипции с феноменом метилирования ДНК служат опыты с аналогом цитидина 5-азацитидином. Последний включается в реплицирующуюся ДНК и в силу своей химической структуры (N вместо С в позиции 5) не может быть метилирован. Его деметилируюшее ДНК действие, однако, в большей степени обусловлено тем, что 5-азацитидин служит "ловушкой" для ДНК- метилтрансферазы и блокирует ее активность.

Во многих случаях продемонстрирована возможность транскрипционной реактивации метилированных генов и генетических конструкций после применения 5-азацитидина как деметилирующего агента. Более того, этот тест в ряде случаев является решающим свидетельством вовлечения метилирования в тот или иной фенотипический признак. Его ограничением, однако, является возможность побочных эффектов [8].

2.4 Dnmtl: ДНК-метилтрансфераза 1 белок и Dnmt3: ДНК-метилтрансфераза 3 белок

Dnmtl- наиболее изученный сегодня фермент системы метилирования ДНК у позвоночных. О важной функциональной роли этого фермента свидетельствует то обстоятельство, что гомозиготная делеция Dnmt1 у мышей ведет к летальному исходу на эмбриональной стадии развития. ДНК-метилтрансфераза 1 - белок с молекулярной массой ~190 кДа, в котором выявлены два домена: каталитический, расположенный в С-концевой трети белка и структурно-близкий бактериальным цитозиновым метилтрансферазам, и регуляторный, расположенный в N-концевой части и содержащий сигнальную последовательность, направляющую фермент в активные репликативные комплексы в делящихся клетках.

Ферментативная активность Dnmtl резко возрастает с началом синтеза ДНК. Возможно, это обусловлено тем, что промотор Dnmtl активируется продуктом гена H-ras, участвующим в одном из главных путей переноса митогенного сигнала.

Репликативный комплекс включает в себя и ДНК-метилтрансферазу 1, благодаря чему в первые минуты после репликации профиль метилирования дочерней нити ДНК воссоздается по образцу материнской. Вместе с тем слабая способность ДНК-метилтрансферазы 1 метилировать ДНК de novo (наибольшую активность этот фермент проявляет по отношению к полуметилированным матрицам, т.е. к ДНК, одна нить которых уже метилирована и тот факт, что в клетках с нокаутированным геном Dnmtl метилирование de novo трансфицированной ДНК все же происходит, заставляют усомниться в том, что наряду с поддерживающим метилированием Dnmtl способна осуществлять и метилирование de novo. Клонированы гены, продукты которых проявляют высокую способность метилировать ДНК de novo и которые, возможно, ответственны за этот процесс in vivo.

Две ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a и Dnmt3b, необходимы, как оказалось, и для метилирования de novo, и для эмбрионального развития мыши. Инактивация соответствующих генов несовместима с развитием зародыша, блокирует реакцию de novo, но в то же время не оказывает влияния на поддерживающее метилирование импринтированных генов. Мишенями Dnmt3a и Dnmt3b являются, по-видимому, разные участки генома. Функции четвертого фермента Dnmt2 пока неясны.

2.5 Метилирование генома как динамический процесс

Представленная картина метилирования носит описательный характер и не объясняет, какие силы определяют сложную мозаику метилирования геномной ДНК и, в частности, что защищает CpG-островки от экспансии этого процесса (известно, что транскрибируемые гены и их промоторы находятся зачастую в окружении интенсивно метилированных последовательностей, таких как повторы Alu). В том же ряду стоит факт существования лишь частично метилированных сайтов CpG (неясно, что препятствует их полному метилированию). Весьма привлекательной с этой точки зрения представляется гипотеза, согласно которой стабильный профиль метилирования генома - иллюзия. На самом деле это лишь внешнее проявление динамического равновесия постоянно действующих и противостоящих друг другу процессов экспансии метилирования и защиты от неё. Гипотеза возникла как результат анализа метилирования 5'- последовательностей гена Aprt.

2.6 Метилирование ДНК: влияние на структуру хроматина

Хроматин существует в двух основных состояних - эухроматина (деконденсирован, потенциально активен, реплицируется в ранней фазе S клеточного цикла) и гетерохроматина (конденсирован, неактивен, реплицируется в поздней S-фазе).

Активация генов, входящих в состав неактивного хроматина, требует изменения структуры хроматина и деметилирования ДНК. Обнаружены белковые комплексы, способные реактивировать неактивный хроматин. Деметилирование может происходить пассивно через подавление функционирования поддерживающих Мтаз. В этом случае дочерние цепи ДНК, образующиеся в процессе репликации, остаются неметилированными, что приводит к полному деметилированию ДНК после двух раундов репликации. Активное деметилирование ДНК происходит с участием специфических ферментов - деметилаз.

Гены, входящие в состав неактивного хроматина, в большинстве своем недоступны действию факторов транскрипции. Формирование неактивного хроматина через метилирование специфических последовательностей приводит к уменьшению линейных размеров генома и числа регуляторных последовательностей, доступных факторам транскрипции. Следствием этого является снижение неспецифических взаимодействий регуляторных белков с соответствующими последовательностями генов, что, в свою очередь, уменьшает уровень информационного шума в генетической системе, который может появляться в результате неконтролируемой транскрипции. В этой связи высказывается предположение о важной роли не только генетических, но и видоспецифических эпигенетических изменений в эволюции высших эукариот.

Факторами, в значительной степени определяющими структуру и функции хроматина, являются модификации его компонентов - ацетилирование гистонов (ведет к деконденсации и активации) и метилирование ДНК (ведет, напротив, к конденсации и инактивации). Таким образом, характерными чертами активного хроматина являются гиперацетилирование гистонов и отсутствие 5-метилцитозина, а неактивного - гиперметилирование цитозина и деацетилирование гистонов. Связь между репрессорным влиянием метилирования ДНК на транскрипцию и деацетилированием гистонов будет рассмотрена ниже.

Действительно, наследуемый характер паттернов метилирования геномной ДНК способствует стабилизации и распространению в популяциях специфических структур хроматина, а изменение паттернов через эпигенетические мутации может быть одним из путей повышения пластичности генетической информации и ее разнообразия, что может служить материалом для естественного отбора.

Примером подавления экспрессии генов путем формирования хроматина, структурированного специфическим образом, является инактивация одной из X-хромосом самок млекопитающих.

Большинство генов неактивной X-хромосомы прекращает свою экспрессию в раннем эмбриогенезе независимо от наличия в ней CpG-последовательностей. При этом метилирование ДНК и ацетилирование гистона H4 усиливают и стабилизируют репрессированное состояние неактивной X-хромосомы.

Регуляторные белки, например, вирусный белок MDBP1 и белки человека MeCP1/2, а также комплекс белков MDBP2 и гистона H1. Если белок MeCP2 для своего взаимодействия требует присутствия в соответствующем участке ДНК только одного метилированного CpG, а белок MeCP1 связывается с ДНК лишь при наличии нескольких метилированных динуклеотидов. С использованием специфических антител было установлено, что белок MeCP2 локализован преимущественно в G-полосах гетерохроматина метафазных хромосом. Гомозиготные делеции в гене этого белка летальны для мышей, что указывает на важную роль MeCP2 в эмбриогенезе животных. Комплекс MDBP2-гистон H1 может связываться с участком ДНК, содержащим единственный метилированный CpG, и ингибировать транскрипцию. При этом белково-нуклеиновое взаимодействие усиливается после фосфорилирования белков.

Дата добавления: 2015-12-08