Метилирование ДНК: методы исследования: общие сведения

На протяжении более 50 лет изучения феномена применялись разные методы, как количественной его оценки, так и статуса метилирования специфических участков генома. Суммарное содержание метилированного цитозина в ДНК оценивают после ее предварительного кислотного или ферментативного гидролиза. 5-Метилцитозин выявляют разными способами (одномерные или двумерные хроматография и электрофорез, газовая хроматография, масс- спектрометрия, HPLC) и измеряют его относительное содержание.

Конъюгаты 5-метилцитозина с сывороточным альбумином могут быть использованы для получения антител, которые эффективно (хотя и не абсолютно специфично) выявляют в ДНК малые количества этого модифицированного основания. 5-метилцитозин в ДНК выявляется секвенированием по Максама и Гилберту. Поскольку модифицированное основание в меньшей степени, чем цитозин или тимин, реагирует с гидразином, то в секвенирующем геле соответствующая полоса отсутствует. Подтверждение может быть получено секвенированием комплементарной нити.

Метилирование исследуется чувствительными к 5-mC рестриктазами. Используют рестрикционные эндонуклеазы, чувствительные и нечувствительные к метилированию остатков цитозина (такие, например, как пары НраII и MspI, SmaI и XmaI). В сочетании с гибридизацией методом Саузерна этот способ позволяет установить, метилирован ли сайт узнавания соответствующих рестриктаз. Применимость подхода ограничена тем, что набор соответствующих изошизомеров не покрывает всех CpG-динуклеотидов.

1.1 Выделение ДНК

Для выделения нуклеиновых кислот из биологических материалов необходимо провести лизис клетов, инактивацию клеточных нуклеаз и отделение искомых нуклеиновых кислот от клеточной массы. Часто идеальная процедура лизиса является компромиссом нескольких методик; она должна быть достаточно жёсткой, чтобы разрушить структуры сложного исходного материала (например, тканей), и при этом должна быть достаточно деликатной, чтобы оставить в неприксновенности целевые нуклеиновые кислоты. Обычная процедура лизиса включает:

· Механическое разрушение (например, измельчение, гипотонический лизис).

· Химическую обработку (например, лизис с помощью детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое восстановление).

· Ферментативное расщепление белков (например, с помощью протеинкиназы К).

Процессы разрушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных нуклеаз могут быть совмещены. Например, один раствор может содержать детергенты для растворения клеточной мембраны и хаотропные соли для инактивации внутриклеточных ферментов. После лизиса клеток и инактивации нуклеаз, клеточная масса может быть легко удалена с помощью фильтрации или осаждения.

Методики очистки нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов обычно являются комбинацией двух или боле из следующих методов:

· Выделение/осаждение.

· Хроматография.

· Центрифугирование.

· Аффинное разделение.

Выделение/осаждение часто используется для удаления примесей из нуклеиновых кислот. Применяется экстракция растворителями. Например, их комбинация: фенол-хлороформ часто используется для удаления белков. Осаждение изопропанолом или этанолом обычно применяется для концентрирования нуклеиновых кислот. Если содержание целевых нуклеиновх кислот небольшое, к смеси может быть добавлен инертный носитель (такой как гликоген) для того, чтобы увеличить эффективность преципитации. Другие методы осаждения нуклеиновых кислот включают селективную преципитацию с использованияем высоких концентраций солей («высаливание»), либо осаждение белков с использованием переменного рН.

Хроматографические методики могут использовать различные технологии разделения, такие как гель-фильтрация, ионообменная хроматография, селективная адсорбция, либо аффинное связывание.

Селективное центрифугирование является мощным методом, используемым для очистки. Например, ультрацентрифугирование в самоформирующихся градиентах хлористого цезия при больших ускорениях уже давно используется для очистки плазмид. Часто центрифугирование комбинируют с каким-либо другим методом. Например, клоночная хроматография при вращении, которая объединяет гель-фильтрацию и центрифугирование для очистки ДНК или РНК от низкомолекулярных примесей (солей, нуклеотидов и др.), для смены буфера или для селекции по размеру.

В последние годы всё больше методик очистки объединяют аффинную иммобилизацию нуклеиновых кислот с магнитным разделением. Например, poly (A) + мРНК может быть привязана к магнитным частицам, покрытым стрептавидином, с помощью меченных биотином олигонуклеотидов (oligo (dT)), после чего комплекс частиц может быть удалён из раствора (как и несвязанные примеси) с помощью магнита. Твёрдофазная техника упрощает очистку нуклеиновых кислот, так как способна заменить несколько этапов: центрифугирования, экстракции органическими растворителями и фазавого разделения, одним быстрым этапом магнитного разделения [12].

Пример методики выделения геномной ДНК из парафиновых блоков.

Все шаги, связанные с центрифугированием необходимо проводить при комнатной температуре (15–25°С).

До начала процедуры следует учесть следующие пункты :

1. Доводят все буферные растворы до комнатной температуры.

2. Устанавливают на термостате температуру в 56°С.

3. Если буфер AL и ATL содержат осадок его необходимо растворить нагреванием при температуре 70°С с последующим аккуратным перемешиванием.

4. Убеждаютя, что буфер AW1 и AW2 приготовлены для последующей работы согласно инструкции.

Методика выделения ДНК из парафиновых блоков:

1. Используют скальпель для удаления парафина с образцов.

2. Делают срезы толщиной 5–10 мм. Если поверхность образца соприкасается с воздухом первые 2–3 среза удаляются.

3. Незамедлительно помещают срезы в 1.5 или 2 мл эппендорфы и добавляют 1 мл ксилена к образцам. Закрывают крышечки эппендорфов и энергично вортексируют в течении 10 секунд.

4. Центрифугируют на максимальной скорости в течении 2 минут при комнатной температуре.

5. Удаляют супернатант, но не удаляют образовавшийся осадок.

6. Добавляют 1 мл этанола (96–100%) к осадку и перемешивают вортексированием. Этанол осаждает оставшийся ксилен с образца.

7. Центрифугируют на максимальной скорости в течении 2 минут при комнатной температуре.

8. Осторожно удаляют оставшийся этанол, используя новые наконечники.

9. Открывают эппендорфы и инкубируют при комнатной температуре (15–25°С) или до 37°С. Инкубируют в течении 10 минут или до того момента пока полностью не испарится оставшийся этанол.

10. Ресуспензируют осадок в 180 мкл буфера ATL. Добавить 20 мкл протеиназы К иперемешать вортексированием.

11. Инкубируют при 56°С в течении часа (или до того момента пока образец полностью не подвергнется лизису).

12. Инкубируют при 90°С в течении часа.

13. Центрифугируют эппендорфы для удаления капель с внутренней стороны крышечки.

14. Добавляют 200 мкл буфера ALк образцу и перемешивают вортексированием. Затем добавляют 200 мкл этанола (96–100%) и снова перемешивают вортексированием.

15. Центрифугируют эппендорфы для удаления капель с внутренней стороны крышечки.

16. Аккуратно переносят весь лизат на колонки не намочив края, закрывают крышечку и центрифугируют при 8000 об/мин. в течении одной минуты. Помещают колонки в чистые collection tube и удалить collection tube содержащие супернатант.

17. Аккуратно открывают колонки и добавляют 500 мкл буфера AW1 не намочив края. Закрывают крышечки и центрифугируют при 8000 об/мин. в течении одной минуты. Помещают колонки в чистые collection tube и удаляют collection tube содержащие супернатант.

18. Аккуратно открывают колонки и добавляют 500 мкл буфера AW2не намачивая края. Закрывают крышечки и центрифугируют при 8000 об/мин. в течении одной минуты. Помещают колонки в чистые collection tube и удаляют collection tube содержащие супернатант.

19. Центрифугируют на максимальной скорости 14000 об/мин. в течении 3 минут для высушивания мембраны полностью.

20. Помещают колонки в чистые эппендорфы и удалить collection tube, содержащие супернатант. Аккуратно открывают крышечки колонок и наносят 20–100 мкл буфера ATE на центр мембраны.

21. Закрывают крышечки и инкубируют при комнатной температуре (15–25°С) в течение одной минуты. Центрифугируют на максимальной скорости (14000 об./мин.) в течение одной минуты.

Пример методики выделения геномной ДНК из цельной крови.

Выделение ДНК из цельной крови можно проводи такими способами: методом водно-метанольной экстракции и с помощью стандартной методики по протоколу «Литех» ("ДНК-ЭКСПРЕСС-кровь").

Последовательность выделения по методу водно-метанольной экстракции:

1. В стерильных условиях с помощью пинчера (диаметр 3 мм) вырезают диск из расчета один диск на 65 мкл конечного объёма;

2. Добавляют 125 мкл метанола (х.ч.д.а), инкубируют при комнатной температуре (+20^оС) в течение 10 минут при постоянном встряхивании (500-700/мин);

3. С помощью автоматического медицинского экстрактора отбирают метанол, дают высохнуть образцам естественным путём (20-25 минут) или центрифугируют в вакуумной центрифуге в течение 10 минут при 500 об/мин;

4. Добавляют 65 мкл бидистиллированной воды и проводят инкубацию в два этапа – 10 минут при +65^оС и еще 10 минут при +98^оС. Инкубируют при постоянном встряхивании в программируемом автошейкере HLC (BioTech, Германия);

5. После инкубирования центрифугируют в течение одной-двух минут при 100 об/мин. Образцы хранят при +4^оС. Несколько лучший «выход» ДНК имеет место в случае клеток, фиксированных на целлюлозном носителе, и наблюдается при дополнительной инкубации при комнатной температуре в течение 10-12 часов.

Стандартная методика выделения ДНК по протоколу «Литех» осуществляется с помощью тест-наборов «ДНК-экспресс-кита» и включает несколько этапов:

1. Пробирки с реагентом, содержащие анализируемый материал, тщательно встряхивают на микроцентрифуге-встряхивателе в течение 10 секунд, помещают пробирку в предварительно прогретый до +98^оС твердотельный термостат и инкубируют при температуре +98^оС в течение 10 минут;

2. После завершения инкубации пробирки центрифугируют при 12000 об/мин при комнатной температуре (+18-25^оС) в течение 15 сек; полученный супернатант используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации. Его можно хранить при температуре +2-8^оС не более одной недели или при температуре -20^оС не более 6 месяцев.

1.2 Бисульфитный метод и постановка амплификации. Определние гиперметилирования генов PTEN, MGMT, p16.

1. Выделяют ДНК из опухолевой ткани (любым методом). Примеры методов выделения ДНК представлены выше.

2. Проводят бисульфитную конверсию (набором Qiagen Bisulfite Kit)

Подготовительный этап:

1. Разводят буфер BW 30 мл спирта (96-100%) и хранят при комнатной температуре.

2. Разводят буфер BD 27 мл спирта (96-100%) и хранят в холодильнике.

3. Разводят лиофилизированный carrier RNA 310мкл dH₂О и храняь при -20С.

4. Готовят смесь разведенной carrier RNA с буфером BL из расчета и хранят в холодильнике (см.Табл.2).

5. Protection буфер хранят в холодильнике, а остальные реагенты при комнатной температуре.

Таблица 2.

Объём BL и разведенной carrier RNA и число образцов

Число образцов
Объем BL	620мкл	1,86мл	2,5мл	3,2мл	5мл
Объем разведенной carrier RNA	6,2мкл	18,6мкл	25мкл	32мкл	50мкл

Бисульфитная конверсия:

1. Разводят одну пробирку Bisulfite mix 800 мкл dH₂О (на 8 образцов) и хранят в холодильнике 2 недели.

2. Готовят смесь по схеме (см.Табл.3):

Таблица 3.

Смесь для бисульфитной конверсии

Компоненты	Объем (мкл)
Раствор ДНК 280-300 нг	До 20
dH2О	До 20
Bisulfite mix
Protection буфер
Общий объем

3. Вортексируют, весь раствор должен быть голубым.

4. Осуществляют постановку конверсии (см.Табл.4).

Таблица 4.

Этапы метода

Шаг	Время (мин)	Температура (С)
Денатурация
Инкубация
Денатурация
Инкубация
Денатурация
Инкубация
	∞

Отмывки:

1. Центрифугируют, чтобы убрать конденсат. Переносят образцы в чистые эппендорфы объемом 1,5.

2. Вносят 310 мкл свежего буфера BL+, вортексируют, центрифугируют.

3. Вносят 250мкл спирта (96-100%), вортексируют 15 сек, центрифугируют. Переносят смесь на колонки. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат

4. Вносят 500 мкл буфера BW. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

5. Вносят 500 мкл буфера BD. Инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

6. Вносят 500 мкл буфера BW. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

7. Вносят 500 мкл буфера BW. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат.

8. Помещают колонки в новые Collection tubes. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов, убирают фильтрат. Можно подсушить 5 мин при 56 С.

9. Помещают колонки в чистые эппендорфы объемом 1,5. Вносят 20 мкл EB буфера в центр мембраны. Центрифугируют 1 мин на 14тыс оборотов [13, 14].

Таблица 5.

Праймеры MGMT, Р16, PTEN

Праймеры	Последовательность
MGMTf неметилированный	5’-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3’
MGMTr неметилированный	5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3'
MGMTf метилированный	5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'
MGMTr метилированный	5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'
First PCR: Р16Мf метилированный	5′ -TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CG-3'
Р16М2r метилированный	5′ -CCA CCT AAA TCG ACC TCC GAC CG -3'
Second PCR: Р16Мf метилированный	5′ -TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CG-3'
Р16М2r метилированный	5′ -GAC CCC GAA CCG CGA CCG TAA-3'
First PCR: Р16Uf неметилированный	5′-TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TG-3
p16U2r неметилированный	5′-CCA CCT AAA TCA ACC TCC AAC-3'
Second PCR: p16Uf неметилированный	5′-TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TG-3'
p16Ur неметилированный	5′-CAA CCC CAA ACC ACA ACC ATAA -3'
PTENf метилированный	5'-TTCGTTCGTCGTCGTCGTATTT-3'
PTENr метилированный	5'-GCCGCTTAACTCTAAACCGCAACCG-3'
PTENf неметилированный	5’-GTGTTGGTGGAGGTAGTTGTTT-3’
PTENr неметилированный	5'-ACCACTTAACTCTAAACCACAACCA-3'

Следующий этап – это определние гиперметилирования генов PTEN, MGMT, p16 (примеры праймеров MGMT, Р16, PTEN в табл.5):

PTEN. Используют праймеры по 2 мкл. (Met F, Met R, Nmet F, Nmet R), ДНК 8,5 мкл., амплификационная смесь 12,5 мкл.

Програма амплификации:

1.95º - 5 мин.

2. 94º- 10 сек.; 62º - 10 сек.; 72º - 10 сек. (№2 повторить 40 раз).

3. 72º - 2 мин.

4. 10º - 10 мин.

MGMT. Используют праймеры по 2 мкл. Met F, Met R, Nmet F, Nmet R), ДНК 7 мкл., амплификационная смесь 12,5 мкл., 1,5 мкл. dH²O.

Програма амплификации:

1.95º - 5 мин.

2. 95º- 10 сек.; 59º - 10 сек.; 72º - 10 сек. (№2 повторить 40 раз).

3. 72º - 2 мин.

4. 10º - 10 мин.

р16. Используют праймеры по 2 мкл. Met F, Met R, Nmet F, Nmet R), ДНК 7 мкл., амплификационная смесь 12,5 мкл., 1,5 мкл. dH²O.

Програма амплификации:

1.95º - 3 мин.

2. 95º- 10 сек.; 65º - 10 сек. для метилированных; 58º - 10 сек. для неметилированных; 72º - 10 сек. (№2 повторить 40 раз).

3. 72º - 2 мин.

4. 10º - 15 сек.

Далее благодаря электрофорезу осуществялют оценку и сравнение метилированных и неметилированных участков ДНК, т.е. исследовать статус метилирования отдельных генов (см.Рис.5):

Рис.5. Определение гиперметилированных участков.

Гиперметилированные участки при УФ свете будут светиться (пример на прямоугольнике 1). Неметилированная ДНК (прямоугольник 2) при УФ свете будет светиться вся равномерно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проделанной работы, были изучены основные теоретические аспекты метилирования ДНК: общие сведения, физиологическая роль и роль в канцерогенезе, биохимия метилирования. Значимое место в работе приобрело изучение основных методов исследования метилирования ДНК.

Опираясь на изученный материал, следует отметить, что характерной чертой опухолевых и трансформированных in vitro клеток млекопитающих является дисбаланс метилирования геномной ДНК, который вносит значимый вклад в создание генетической и фенотипической нестабильности. В тоже время, нестабильность 5-МеС в составе CpG динуклеотидов, приводящая к эпимутациям, может иметь тот же конечный итог. Таковым образом, метилирование, являясь эпигенетической модификацией ДНК, может в случае нарушения приводить к генетическим изменениям, делая очевидной взаимосвязь меж генетическими и эпигенетическими действиями при возникновении и развитии опухоли.

Нарушение паттерна метилирования проявляется на ранешних стадиях злокачественной трансформации клеток млекопитающих. С медицинской точки зрения это открывает способности для ранешней диагностики и исцеления заболевания. Тем более, что в различие от мутаций, которые принципиально необратимы, модификации ДНК, хотя и очень стабильны, но принципиально обратимы.

Дата добавления: 2015-12-08