Метилирование ДНК у млекопитающих

1.1 Метилирование ДНК: общие сведения

Метилированные основания в ДНК обнаружены свыше 50 лет назад. ДНК прокариот содержит модифицированные основания N6-метиладенин и 5-метилцитозин, тогда как ДНК высших эукариот - в основном 5-метилцитозин. Метилирование остатков цитозина ДНК имеет место у бактерий, растений, животных, в том числе млекопитающих (включая человека), но отсутствует у дрожжей, нематод и дрозофилы. Обнаружено, что в ДНК дрозофилы содержится 5-метилцитозин. Метилирование осуществляется ферментативно в первые минуты после репликации ДНК, т.е. пострепликативно. Поскольку нуклеотидная последовательность ДНК при этом не меняется, метилирование по сути своей - событие эпигенетическое. Оно, хотя и является стабильной и наследуемой модификацией, в принципе обратимо под воздействием деметилирующих агентов или ферментов и тем самым принципиально отличается от мутаций ДНК. В общебиологическом плане феномен метилирования является элементом системы распознавания "свой-чужой". Благодаря существующей в бактериях системе метилирования-рекогниции (рестрикции-модификации) клетки способны идентифицировать свой генетический материал и отличать его от инородных молекул, проникших в клетку тем или иным способом. Уничтожение последних позволяет поддерживать генетическую стабильность вида. Иногда один фермент имеет две - метилазную и эндонуклазную - активности, в большинстве случаев определенный сайт ДНК распознается двумя ферментами, один из которых метилирует его, а другой расщепляет. В целом система функционирует таким образом, что метилазы "метят" специфические последовательности собственной ДНК, а чувствительные к метилированию рестрикционные эндонуклеазы узнают и расщепляют те из последовательностей, которые соответствующей метки не имеют. Так, бактериальная клетка защищает себя от вторжения чужеродных молекул. Например, ДНК проникшего в бактериальную клетку фага, расщепляется в определенных сайтах специфическими эндонуклеазами, в то время как те же последовательности в собственной ДНК защищены от расщепления, поскольку метилированы. Роль метилирования ДНК как компонента клеточной "иммунной системы", предназначенной для уничтожения чужой или излишней ДНК (или подавления ее функций), сохраняется по-видимому, на протяжении эволюции, но конкретные механизмы реализации этой задачи могут быть существенно иными. Например, клетки Neurospora элиминируют нежелательные повторяющиеся последовательности посредством интенсивного их метилирования, за которым следует накопление точковых мутаций из-за высокой мутабельности остатков 5-метилцитозина. Подобным же образом в клетках грызунов и человека интегрированные вирусные последовательности могут подвергаться метилированию и обусловленному им стабильному блоку транскрипции. Известно также, что инактивации тем же способом нередко подвергаются трансгены у мышей.

В широком эволюционном плане переходы от прокариот к эукариотам и от беспозвоночных к позвоночным сопровождались, по-видимому, резким увеличением числа генов. Эти драматические изменения вызвали к жизни, видимо, и новые способы ограничения нежелательной активности "лишних" генов - формирование ядерной мембраны и нуклеосомную организацию хроматина в первом случае, функциональную переориентацию системы метилирования - во втором. Если у беспозвоночных она сводилась к подавлению активности потенциально опасных последовательностей ДНК (таких как вирусы и транспозоны), то у позвоночных ее назначение - еще и стабильная репрессия эндогенных генов (гены инактивированной хромосомы X, импринтированные гены, часть тканеспецифичных генов). Профиль метилирования, сильно влияющий на функциональное состояние гена, стабильно передается в ряду клеточных поколений. С этой точки зрения, для организмов с большой продолжительностью жизни и интенсивной тканевой регенерацией (позвоночные, растения) надежная система эпигенетической наследственности (типа метилирования ДНК) жизненно необходима. В противоположность этому у маленьких животных и животных с малой продолжительностью жизни, т.е. в ситуациях, когда значительное новообразование клеток отсутствует, такой необходимости нет. Предполагают, что именно этим обстоятельством объясняется отсутствие системы метилирования ДНК у нематод и дрозофилы.

У млекопитающих метилирование ДНК служит цели стабильного функционального подавления части генетического материала. У млекопитающих на протяжении всей жизни животного функционирует относительно малая доля генома (~5%), тогда как большую его часть составляет генетический. Последний подвергается интенсивному метилированию. Активация метилирования, кроме того, отмечена при различных процессах, приводящих к появлению новой ДНК: трансфекция ДНК, разного рода дупликации инициируют процесс модификации появившихся копий. Особой стимулирующей активностью в этом отношении обладают инвертированные повторы. Таким образом, повторяющиеся последовательности, с одной стороны, и присутствие 5- метил-цитозина, с другой, - характерные и взаимосвязанные признаки эукариотических геномов. Одни повторы, накапливавшиеся в геноме человека на протяжении эволюции, по-видимому, функционально бесполезны, другие (транспозоны) потенциально опасны. Естественно поэтому, что они сильно метилированы и, как следствие, неактивны, их транскрипция чревата для клетки метаболическим хаосом. Метилированные участки "ущемлены" и в другом отношении - они позже, чем активные последовательности, реп- лицируются в фазе S клеточного цикла. Что касается конкретного механизма блока транскрипции, индуцированного метилированием, то он опосредован изменением структуры хроматина.

1.2 Метилирование ДНК генома млекопитающих

Общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков в молекуле ДНК метилирована, т.е. находится в форме 5-метилдезоксицитидина. Экспериментальное изучение характера метилирования основано на сопоставлении рестрикционных фрагментов, образующихся после обработки ДНК эндонуклеазами, для которых сайты узнавания одинаковы и содержат в своем составе цитозин, но действуют эти ферменты по-разному, в зависимости от того, находится ли это основание в метилированном состоянии или нет. В частности, рестриктазы Mspl и HpaII узнают последовательность ССGG, но, в отличие от Mspl, HpaII не расщепляет ДНК в тех сайтах, где внутренний СрG-динуклеотид метилирован. Некоторые сегменты генома, особенно это относится к повторяющимся последовательностям, полностью метилированы в местах 5'-ССGG-3' и частично метилированы в 5'-GСGС-3' - сайтах рестрикции для Hhal. В других сегментах наблюдается характерный рисунок частичного метилирования в 5'-ССGG-3' последовательностях. Различные индивидуумы, независимо от их этнического происхождения, практически не различаются по характеру метилирования ДНК в одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогенетической дифференцировки происходят значительные изменения рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опухолевого происхождения число метилированных сайтов резко уменьшено. Высказано предположение о наличии прямой связи между метилированием ДНК и состоянием генетической активности в клетках.

Существует класс белков, которые специфическим образом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, возможно, и для полимераз.

Получено много прямых экспериментальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а значит, и в регуляции активности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области генов, в особенности СрG-островков, как правило, свидетельствует о функциональной активности генов. Показано, что необычные структуры в молекуле ДНК, как и экзогенная ДНК, встроившаяся в процессе генетической трансформации, нередко подвергаются метилированию.

Известно, что метилирование играет важную роль в инактивации Х-хромосомы у самок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (геномного) импринтинга, связанного с различной пенетрантностью некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, т. е. прохождения через материнский или отцовский гаметогенез.

1.3 Распределение CpG динуклеотидов в геноме человека

В клетках млекопитающих главное основание ДНК, подвергаемое энзиматическому метилированию - цитозин. Основной мишенью метилирования в цепях ДНК служит последовательность CpG. Динуклеотиду CpG в одной нити ДНК соответствует тот же динуклеотид в противоположной нити (в силу их комплементарности и антипараллельности). Это облегчает функцию поддерживающего метилирования, вступающего в действие сразу после репликации ДНК и воссоздающего профиль метилирования дочерней нити по образцу материнской. Количество и распределение динуклеотидов CpG в геноме - факторы, имеющие большое значение для понимания функции метилирования ДНК.

1.4 CpG-супрессия

5-Метилциитозин гипермутабелен, (поскольку аминогруппа в положении 6 крайне нестабильна) и может подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием тимина. Это обстоятельство вело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G-C на А-Т, в результате чего в геноме человека динуклеотидов CpG в ~5 раз меньше (частота ~1 динуклеотид на 80), чем следовало бы (1 на 16). Это явление получило название CpG- суппрессии.

1.5 CpG-островки

В GC богатых изохорах локализовано большое количество СрG- островков- последовательностей от 500 до 2000, характеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина (G+С более 60%), представленных в виде кластеров неметилированных СрG-дуплетов и так называемых G/С-боксов - локусов, родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных факторов Spl - (G)4С(G)4С. СрG-островки содержат много сайтов узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих неметилированные СрG-дуплеты. В частности, более 80% Nor 1-сайтов связано с СрG-богатыми островками.

Характерным свойством CpG-островков является их локализация вблизи структурных генов, преимущественно в их 5'-участках (регуляторные последовательности, промоторы, последовательности первого экзона). Анализ полностью расшифрованных к настоящему моменту нуклеотидных последовательностей хромосом 21 и 22 человека подтверждает это общее положение. Формальные признаки CpG-островков (присутствуют в промоторных зонах примерно 60% генов человека):

- размеры от 0,5 до 5 тыс. пар оснований;

- встречаемость примерно 1 на 100;

- обычное (т.е. соответствующее расчетному 1:16) содержание CpG динуклеотида;

- С + G превышает 60%; отношение CpG/GpC не менее 0,6.

За несколькими известными исключениями (см. выше) CpG-островки не метилированы во всех типах тканей независимо от экспрессии соответствующего гена. С этой точки зрения важен вопрос о пространственной соотношении структурных генов и CpG-островков. Примерные расчеты свидетельствуют о том, что свыше половины генов, составляющих функционирующий геном человека. содержат CpG-островки: они имеются, по-видимому, у всех генов, выполняющих базовые клеточные функции (генов домашнего хозяйства), и у примерно 40% генов, выполняющих специализированные функции. Значительная часть тканеспецифических генов не имеет в своих промоторах CpG- островков: вместо них могут присутствовать одиночные CpG-динуклеотиды.

Наибольшая плотность СрG-островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9, 15, 16, 17,19, 20,22. Точные молекулярные методы регистрации СрG-островков показали, что их число в геноме человека приближается к 45 000.

1.6 Метилирование одиночных CpG-динуклеотидов

Степень метилирования одиночных CpG-динуклеотидов варьирует в широких пределах и может быть различной в разных клетках и тканях. Метилирование в этом случае не оказывает широкомасштабного влияния на структуру хроматина, как это происходит в случае метилирования CpG-островков, а действует относительно локально, препятствуя связыванию факторов транскрипции, и в специализированных клетках может иметь тканеспецифичный характер. Примерами такого сайт-специфичного метилирования и связанного с ним подавления транскрипции может быть ситуация с промотором GK-интерферона и участком связывания CREB в промоторе гена бета-глобина. Очевидно, однако, что репрессирующая роль метилирования одиночных CpG-динуклеотидов в случае тканеспецифических генов ограничивается теми из них, в регуляции которых участвуют чувствительные к метилированию факторы транскрипции. Это положение продемонстрировано недавно в экспериментах, где было показано, что у дефицитных по ДНК-метилтрансферазе мышиных эмбрионов деметилирование ДНК не приводит к несвоевременной или эктопической активации исследованных тканеспецифичных генов. По-видимому, в экспрессии значительной части тканеспецифичных генов метилирование не играет существенной роли и она контролируется другими механизмами.

Дата добавления: 2015-12-08