И прорастания пыльцевых зерен.

У высших цветковых растений гаметофит редуцирован и сведен до образования зародышевого мешка (макрогаметогенез) и прорастания пыльцы (микрогаметогенез). Анализ микрогаметогенеза, а также морфологии зрелых пыльцевых зерен позволяет оценить параметры фертильности растений. Это особенно важная задача для генетиков в тех случаях, когда изучается генетический контроль фертильности, например, при выявлении автофертильных форм среди автостерильных растений или в случае выявления широко используемой в селекции и в разведении многих гибридных растений цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС).

В практике селекции широко используются триплоидные формы растений. Из-за нарушения спаривания хромосом в мейозе они оказываются стерильными. В целом явление поли­плоидии, повышающее продуктивность растений, сопровожда­ется некоторым снижением фертильности, что может быть вы­явлено при морфологическом анализе пыльцы с использованием различных методов ее окраски. Например, содержа­щую крахмал пыльцу окрашивают йодом и ацеторсеином, изучая появление уродливых пыльцевых зерен, слабоокрашенных, «невыполненных», т. е. абортивных, клеток. Для этих целей необходимо использо­вать только зрелую пыльцу полиплоидной ржи или ячменя.

Нарушения морфологии пыльцы, резкое снижение ее количества в пыльниках, нарушения морфологии цветка в целом, препятствующие его опылению насекомыми — пере­носчиками пыльцы может быть связано с апомиктическим развитием. Апомиксис (бесполосеменное размножение — партеногенез) за­служивает особого изучения, поскольку он своеобразный вариант сохранения генотипа получаемых гетерозисных ком­бинаций скрещивания. Кроме диплоидного партеногенеза, у растений встречается гаплоидный партеногенез — гиногенез и андрогенез, при которых развиваются гаплоидные растения на основе генома материнской споры или генома мужских половых клеток, проникающих в зародышевый мешок по мере прорастания пыльцы. Кроме названных способов апомиксиса существуют и другие варианты. Например, апогамия — об­разование зародыша за счет других клеток зародышевого меш­ка — синергид или антипод. Апоспория — развитие зароды­шевого мешка, а затем и зародыша без предшествующего мейоза и гаметогенеза. Описаны и другие случаи апомиксиса.

Диплоидный партеногенез наблюдается у видов из семей­ства сложноцветных — у одуванчика, крапивы и др. Гапло­идный партеногенез (чаще гиногенез) отмечается у представи­телей семейства пасленовых — у дурмана, табака и др. Апогамия наблюдается у манжетки (Alchemilla sp.), зародыш которой образуется из синергиды, у отдельных видов лука, где он возникает из антиподы. Апоспория отмечается у ястребинок (Hieracium sp.), полыни (Artemisia sp.).

Еще один метод оценки фертильности пыльцы – нарушение прорастания пыльцевых зерен. Такие нарушения могут быть следствием различных генетических причин, в том числе отдельные ген­ные мутации или хромосомные перестройки, оказывающиеся в гаплоидном состоянии, могут сказываться на признаках мужского гаметофита.

В живом растении пыльца прорастает на рыльце, образуя пыльцевую трубку. Прорастание пыльцы вызывается особыми веществами, содержащими сахара, которые выделяются клет­ками зрелого рыльца. Однако можно прорастить пыльцу и в искусственных усло­виях: на предметном стекле в элементарной искусственной среде — растворе сахарозы определенной концентрации для различных видов растений. Так, для пыльцы лука и тюльпана лучшей является 3%-ная концентрация сахарозы, для пыль­цы ландыша — 15%-ная и т. д. Концентрации сахарозы опре­деляют опытным путем.

При температуре около 20 °С у некоторых растений уже через 15—20 мин под микроскопом обнаруживается прора­стающая пыльца (рис. 4). Легко заметить, что пыльцевые труб­ки развиваются не одновременно: у одних пылинок трубка короче, у других — длиннее. Через некоторое время следует подсчитать количество не проросших пальцевых зерен или тех, у которых рост трубки остановился в начале процесса.

Рис. 4. Разные стадии прорастания пыльцы растений на искусственной среде.

Проросшие пыльцевые зерна на покровном стекле можно окрасить ацеторсеином и увидеть в трубках один или два (в зависимости от длины трубки) ядра (спермия).

Работа 1. Цитохимический метод анализа фиртильности пыльцевых зерен.

Оборудование: предметные и покровные стекла, стеклянная палочка, пипетка, химический стакан, микроскоп (ув. 15х60).

Реактивы: растворы: 0,2 г основного бензидина на 100 мл 55% этанола

0,15 г α-нафтола на 100 мл 55% этанола;

0,25 г гидрокарбаната натрия на100 мл дист. воды;

3% водный раствор перекиси водорода.

Первые три раствора готовят заранее, раствор перекиси водорода готовят непосредственно перед употреблением.

Объекты: зрелая пыльца ржи, пшеницы, лука, ландыша.

Ход работы

Первые три раствора смешивают в равных количествах непосредственно перед приготовлением препарата; на предметное стекло высыпают пыльцу и на нее наносят каплю смеси первых трех растворов и каплю раствора перекиси примерно в равных объемах; в этих растворах на стекле пыльцу тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Окраска длится примерно 5 мин под покровным стеклом. Нор­мальная пыльца, содержащая пероксидазу, окрашивается в яркий малиново-красный цвет. Интенсивность окраски зави­сит от количества фермента пероксидазы. Отсутствие окраски (желтизна) характерна для аномальных пыльцевых зерен. Их следует подсчитать на свежесобранной пыльце или на пыль­це, собранной некоторое время назад. Оцените соотношение красных, розовых и желтых (неокрашенных) пыльцевых зерен в разные сроки их хранения после сбора. Хранить нужно пыльцу в не удаленных из цветка пыльниках, поместив цветки в различные условия влажности и температуры. Запротоколируйте результаты.

Работа 2. Определение фертильности растений по прорастанию пыльцы.

Оборудование: чашка Петри, фильтровальная бумага, световой микроскоп, предметные и покровные стекла, химический стакан, пипетка.

Реактивы: растворы сахарозы 3, 5, 10, 15% концентрации, ацетокармин.

Объекты: зрелая пыльца растений из различных по условиям антропогенной нагрузки мест, пыльца полиплоидных и апомиктических растений.

Ход работы

Приготовьте раствор сахарозы разной кон­центрации (3, 5, 10 и 15%-ные). Кап­лю сахарозы (лучше смесь глюкозы, фруктозы и сахарозы в соотношении 1:1:1) поме­щают на предметное стекло. На эту среду напыляют зрелую пыльцу злаков, бобовых или других растений. Предметное стекло с пыльцой помещают во влажную камеру, например в чашку Петри, в которой и дно, и крышка покрыты фильтро­вальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде. Каме­ру хранят при комнатной температуре или в случае хорошей теплой погоды непосредственно в поле. Оптимальная темпера­тура прорастания пыльцы 20—25 °С. Препарат необходимо предохранять от прямого попадания солнечных лучей и пере­грева. Через 30—60 мин пыльцевые трубки будут достаточно велики, чтобы подсчитать количество не проросшей пыльцы. Пронаблюдайте рост пыльцевых трубок в разные сроки после начала прорастания. Через каждые 15 мин отмечайте увеличе­ние длины трубки, процесс роста. Сделайте рисунки в дневнике. Когда размер пыльцевых трубок будет максимальным и рост их прекратится, можно произвести окраску проросших тру­бок ацетокармином или ацеторсеином прямо на поверхности раствора сахарозы и пронаблюдать за поведением ядер спермиев. Среди пыльцевых клеток отметьте общее количество пыльцы (просчитав ее в нескольких полях зрения), количество непро­росшей пыльцу, количество пыльцевых зерен, в трубках ко­торых видно только одно ядро спермия к моменту анализа, оцените их долю среди просчитанных клеток. Такие показатели, как доля не проросшей (часто треснувшей пыльцы) и доля пыльцы, в трубках которых выявляется только один спермий, служат показателями фертильности растений. Выполняя это задание, введите разнообразные условия, которые могли бы отразиться на закономерностях развития пыльцевых зе­рен: генотипы растений (ЦМС, полиплоидия в сравнении с нормой и диплоидными формами, склонность изучаемого вида к апомиксису и др.), условия произрастания изучаемых расте­ний (для представителей дикой флоры используйте те разли­чия, которые вносятся различными антропогенными фактора­ми, загрязняющими среду, — в этом случае количество ано­мальных клеток обязательно будет возрастать); влияние хра­нения пыльцы после ее сбора на закономерности прорастания пыльцевых зерен.

Работа 3. Оценка фертильности пыльцы у полиплоидных злаков.

Оборудование: фильтровальная бумага, световой микроскоп, предметные и покровные стекла.

Реактивы: 0,5% спиртовой раствор йода.

Объекты: зрелая пыльца посевной ржи и ячменя.

Ход работы

В период полного созревания пыльцевых зерен любого растения возьмите пыльник и поместите его на предметное стекло. С помощью препаровальной иглы разорвите пыльник и распределите пыльцевые зерна по поверхности стекла. На стекло нанесите каплю спиртового раствора йода, выявляющего наличие крахмала по синей окраске зерен. Подсчитайте количество слабоокрашенных, «невыполненных» т. е. абортивных клеток. С чем это может быть связано?

Тема 5.

Дата добавления: 2015-07-08