Температура

Интервалы температур, в которых возможен рост различных мик­роорганизмов, заметно варьируют. У мезофилов, к которым относится большинство известных нам форм, температурный оптимум лежит в ин­тервале от 25 до 37°. У термофилов он значительно выше — от 45 до 60—70°. Психрофилы хорошо развиваются в интервале температур 5—10°. Отклонения температуры от оптимальной неблагоприятно влия­ют на развитие микроорганизмов. Поэтому микроорганизмы выращи­ваются в термостатах Мезофильные бактерии, естественным местом обитания которых является вода и почва, выращивают в интер­вале от 20 до 30°, тогда как бактерии кожных покровов, слизистой или ки­шечника человека и животных куль­тивируют при более высокой темпе­ратуре — 35—37°. Для выращивания психрофилов используют холодильные камеры.

Свет

Для роста подавляющего боль­шинства микроорганизмов освещение не требуется. Напротив, прямые сол­нечные лучи отрицательно влияют на их развитие. Поэтому такие микро­организмы выращивают в темноте. Свет необходим для роста фототрофных микроорганизмов. Однако естест­венное освещение используют редко, так как оно непостоянно и плохо контролируемо. Как правило, фототрофы- выращивают в люминостатах, т. е. в камерах, освещенных лампами накаливания или флуоресцентными лампами дневного света. Необхо­димая температура в люминостатах создается благодаря вентиляции или холодильному устройству.

Выбор источника освещения определяется спектром его излучения и длинами волн, при которых осуществляют фотосинтез культивируе­мые микроорганизмы. Для выращивания пурпурных и зеленых бакте­рий лучше использовать лампы накаливания; для культивирования ми­кроводорослей и циаиобактерий можно применять флуоресцентные лампы дневного света.

Вода

Рост и размножение микроорганизмов невозможны без присутст­вия в окружающей среде воды, причем вода должна находиться в до­ступной для клетки форме, т. е. в жидкой фазе. Однако в природных субстратах и питательных средах часть воды ассоциирована с молеку­лами растворенных веществ и не может быть использована микроор­ганизмами. Доступность воды в субстрате для развития микроорганизмов выражают величиной активности. Ее значение для дистиллирован­ной воды равно 1,00. При растворении различных веществ в воде эта величина уменьшается и соответственно падает доступность для клетки воды.

Микроорганизмы могут расти на средах со значением a_w от 0,99 до 0,63. Потребности в доступной воде у бактерий, как правило, выше, чем у дрожжей и микроскопических грибов. Так, большинство бакте­рий, за исключением галофилов, хорошо растет на средах с величиной a_w от 0,99 до 0,95, минимальная величина активности обеспечивающая рост дрожжей, лежит в пределах от 0,91 до 0,88.

Раз­личную активность воды в питательной среде или субстрате создают добавлением к ним таких соединений, как NaCl, глюкоза, глицерин, полиэтиленглнколь, или уравновешиванием небольшого объема среды с большим объемом раствора H₂SO₄ или солей (NaCl, KC1, KNO₃), имеющих определенную активность воды.

Вывод; Для получения максимального выхода целевого продукта процессов ферментации необходимо не только знать физиологические потребности микроорганизмов, но и экспериментально подбирать для них условия культивирования для чего в лабораторной практике применяется принципы математической оптимизации процессов, варьируя разные уровни условий.

Лекция №29

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ

План

1. Подсчет микроорганизмов в счетной камере

2 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках

3 Метод Брида

4 Подсчет микроорганизмов с использованием мембранных фильтров

5 Метод высева на плотные среды

6 Метод предельных разведений

Введение: Для определения общего количества микроорганизмов в различных субстратах, а также численности представителей отдельных групп и ви­дов микроорганизмов применяют ряд методов: прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках, на мембранных фильтрах), выделение и учет высевом на плотные и жидкие питательные среды.

Методы прямого счета клеток под микроскопом дают возможность учесть численность микроорганизмов в субстрате наиболее полно. Однако при этом определяются и живые, и мертвые клетки, и результаты подсчета могут быть не совсем точными.

Методами высева на плотные и жидкие питательные среды учитыва­ются только жизнеспособные клетки микроорганизмов, но в большинстве случаев выявить все разнообразие микроорганизмов субстрата на одной среде не удается вследствие существенных физиологических различий меж­ду ними.

Подсчет микроорганизмов в счетной камере (по Г.Л.Селиберу)

Подсчет микроорганизмов в камерах (Тома, Горяева и других) воз­можен только для клеток с достаточно крупными размерами, позволяю­щими применять при микроскопировании оптические системы со сравни­тельно малым увеличением. Этот метод удобен для счета дрожжей, круп­ных бактерий и спор грибов.

Счетная камера Тома имеет вид толстого предметного стекла, в цен­тре которого находится стеклянная пластинка с выгравированной на ней сеткой

По обе стороны пластинки (а в некоторых камерах вокруг нее) рас­положена другая пластинка на 0.1 мм выше первой. После нанесения на пластинку с сеткой капли исследуемой жидкости к боковой пластинке притирается покровное стекло. Пространство, заключенное между по­кровным стеклом и пластинкой с сеткой, представляет собой камеру глу­биной 0.1 мм. Дном камеры является пластинка с сеткой, разделенная на ряд больших квадратов площадью 1/400 мм². Объем малого квадрата -1/400 мм³, большого -16/400 = 1/250 мм³.

Счет клеток производится следующим образом: подсчитывают все клетки, находящиеся внутри большого квадрата и на пограничных линиях, если клетки большей половиной помещаются в данном квадрате. Если клетки пересекаются пограничной линией пополам, считают только на двух смежных сторонах квадрата, например, на нижней и левой.

Рекомендуется клетки подсчитывать в десяти больших квадратах, в каждой капле, с пятикратной повторностью, т. е. в 50 больших квадра­тах. Объем 50 больших квадратов составляет 1/5 мм³.

Расчет выполняется следующим образом. Допустим, что в 50 боль­ших квадратах (1/5 мм³) было подсчитано 530 клеток. Тогда в 1 мм³ будет 530 х 5 = 2650 клеток, а в 1 мл - 2650 х 1000 = 2650000 клеток. Слишком густые суспензии считать затруднительно, их следует разбавлять водой. Лучше пользоваться разведениями, при которых количество клеток в однлом большом квадрате не превысит 16.

Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках В определенном объеме исследуемой суспензии под микроскопом подсчитывают количество клеток микроорганизмов. Использование фик­сированных мазков дает возможность сохранять препараты длительный срок и проводить подсчет не по ходу опыта, а в удобное для исследователя время.

Метод Брида (по ГЛ.Селиберу)

Точно откалиброванной пипеткой отмеряют 0.01 мл исследуемой жидкости и распределяют на площади в 1 см². Мазок сушат, фиксируют и красят метиленовой синью. Затем определяют площадь поля зрения мик­роскопа и высчитывают, сколько раз она укладывается в 1 см². При помо­щи окуляра-микрометра и объекта-микрометра определяют радиус поля зрения и высчитывают его площадь. Например, при диаметре поля зрения, установленном по объекту-микрометру на 0,16 мм, площадь поля зрения будет равна (с некоторым округлением) 0.02 мм², что составляет 1/5000 см². Эта площадь укладывается в 1 см² 5000 раз.

После этого при помощи иммерсионного объектива считают количе­ство микроорганизмов в отдельных полях зрения микроскопа. Поля зре­ния выбираются произвольно. Подсчитывают количество клеток обыч­но в 30 полях зрения. Для достижения большей точности подсчитывают количество микроорганизмов в 50 или 100 полях зрения.

Затем определяют среднее число клеток в одном поле зрения. На­пример, в 30 полях зрения подсчитано 630 клеток. Следовательно, в одном содержится в среднем 21 клетка (630/30 = 21). Отсюда количество клеток в 0.01 мл исследуемой суспензии равно: 21 х 5000 = 105000. Чтобы узнать, сколько клеток содержится в 1мл, надо умножить данное число на 100: 105000 х 100 = 10500000 клеток.

Подсчет микроорганизмов с использованием мембранных фильтров

Мембранные фильтры были впервые предложены в 30-х гг. нашего столетия (Пирс, 1927; Элфорд, 1930, 1931). В настоящее время из всех веществ, рекомендуемых для приготовления мягких фильтров, используют только растворы целлюлозы (нитроцеллюлозы) в различных растворите­лях. Преимущество мембранных фильтров заключается в возможности ка­либрования (градуирования), т.е. приготовления фильтров с заданной ве­личиной пор. В 1931 г. А.С.Разумов предложил использовать эти фильтры для ускоренного количественного учета микроорганизмов. Особенно ши­рокое распространение они получили при исследовании микрофлоры различных водоемов или жидких субстратов.

Сущность метода заключается в том, что через мембранные фильтры пропускается определенное количество воды (10-20 мл из чис­тых рек, озер и 1 мл - из загрязненных водоемов, сточных вод). Микроор­ганизмы на поверхности мембранных фильтров (после фильтрации) окра­шивают и подсчитывают.

В практике микробиологических исследований в настоящее время используются мембранные фильтры пяти различных градаций пористости 1-5 от 0,35 мкм до 1,2 мкм

Перед употреблением фильтры стерилизуют медленным кипячением в течение 15 мин. В воронку Уленгута наливают стерильно исследуемую жидкость и вставляют ее в колбу Бунзена, которая соединена с водоструй­ным наносом.

После фильтрации фильтр помещают в стерильную чашку Петри и окрашивают 1-5%-ым раствором эритрозина в течение 3-5 часов. Затем фильтр осторожно промывают и помещают для просветления в чашк; Петри (на фильтровальную бумагу) с кедровым или вазелиновым мае лом.

Подсчет количества микроорганизмов на мембранных фильтра; производят с иммерсионной системой микроскопа в 30-100 полях зрения Далее аналогично методу Брида определяют площадь поля зрения микро скопа, высчитывают, сколько раз оно укладывается в площади фильтра находят среднее количество микроорганизмов на поле зрения, пересчеты вают количество микроорганизмов на всю поверхность фильтра и на 1 мл исследуемой воды (жидкости).

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (по Н.С.Егорову)

Существует два варианта данного способа учета: посев на агаризо-ванные среды в чашки Петри и высев в жидкие питательные среды (метод предельных разведений).

Метод высева на плотные среды

Сущность метода заключается в высеве исследуемой пробы почвы на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших коло­ний. При этом считают, что каждая колония является результатом раз­множения одной клетки. Если субстрат содержит большое количество микроорганизмов, то прибегают к разведениям.

Чашечный метод широко используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в почве и других естественных субстра­тах. Применение его позволяет учесть не только численность микроорга­низмов, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний. Работа этим методом проводится в три приема: приготовление разведений, посев в чашки, подсчет выросших колоний.

Разведения делают в стерильном 0.5%- ом водном растворе хлори­стого натрия. Готовят определенный объем этого раствора и стерилизуют его при одной атмосфере. В ходе опыта используют постоянный коэффи­циент разведения. Чаще всего делают десятичные разведения. Стерильный раствор разливают стерильной пипеткой по 9 мл в стерильные сухие про­бирки. Затем переносят стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материа­ла в пробирку с 9 мл раствора хлористого натрия. Если исследуемый мате­риал (например, почва) уже был разведен в 100 раз, получают разведение 1:1000. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают новой сте­рильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Процедуру повторяют 3-5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипет­кой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробир­ку - получают разведение 1:10000. Таким образом готовят и последующие разведения. Степень разведения устанавливается предполагаемым количе­ством микроорганизмов в образце: число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.

Для приготовления каждого разведения обязательно использовать отдельную пипетку. Пренебрежение данным правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышаю­щего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стен­ках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшихся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведе­ний, что и явится причиной получения завышенного результата.

Посев производят на агаризованные среды в чашки Петри. В сте­рильные чашки Петри наливают расплавленную на водяной бане агаризо-ванную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве случаев вы­держивают двое-трое суток при температуре 30 °С крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки ее стерильности. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной.

Посев делают из разведений суспензии в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0.1, 0.2 или 0.5 мл) со ответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного на поверхность агаровой пластинки в чашку Петри. Данный объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим шпателем проводят по всей поверхности среды во второй чашке, куда посевной материал не вносили.

Из каждого разведения делают 4-6 параллельных высевов. При параллельных посевах одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на температуру, благоприятную да развития выявляемых организмов.

Подсчет выросших колоний проводят через некоторое время поел посева, которое зависит от скорости роста выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и при данной температуре. Подсчет бактерий производят на мясо-пептонном агаре при культивировании с температурой 30 °С через трое суток, при комнатной температуре через семь суток Подсчет дрожжей проводят на сусло-агаре при комнатной температуре че рез семь суток, грибов - на сусло-агаре при комнатной температуре чере: 3-10 суток (при температуре 25 °С срок наблюдения за грибами может бьт сокращен до 2-3 дней).

Подсчитывают количество колоний, выросших в чашке Петри, и де­лают пересчет на 1 г. Результаты параллельных высевов суммируют у вычисляют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии считают, не открывая чашки Петри. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки пользуясь стеклографом или чернилами. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют.

Лучшим разведением считают то, при высеве из кото­рого на плотной питательной среде от 50 до 100 колоний. Если число вы­росших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают и для расчета количества клеток в исходном субстрате не используют. Желательно, что­бы общее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разве­дения было не менее 300.

Статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке, поэтому чашечный метод требует большой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки и среды от заражения посторонними микроорганизмами, так как случайно попавшая клетка может завысить число микроорганизмов в исследуемой суспензии. Приготовление разведений и высевы следует производить в боксе.

Описанный метод применим только для учета аэробов и факультативных анаэробов. Для учета строгих анаэробов чашки Петри после посева помещают в анаэробные условия.

Метод предельных разведений

В пробирки или колбы с жидкой питательной средой вносят строго измеренный объем из различных разведений суспензии. Для работы ис­пользуют последовательный ряд десятикратных разведений испытуемого материала. Разведения исходной суспензии готовят так же, как и для ча­шечного метода. После инкубации регистрируют наличие или отсутствии роста, результаты обрабатывают статистически с помощью специальной таблицы и затем рассчитывают число клеток, содержащихся в 1 г (1 мл) исходного субстрата.

Посев в жидкую питательную среду.

Одинаковый объем питательной среды разливают в колбы или про­бирки и стерилизуют. Посев проводят из нескольких разведений с таким расчетом, чтобы в опыт попало то разведение, при высеве из которого рост будет во всех параллельных сосудах, а также то последующее разведение, которое не даст роста ни в одной из параллельных пробирок. Когда это предусмотреть невозможно, делают посев из большого числа разведений. Если в первом опыте границу развития не удается установить, готовят но­вые разведения, увеличив их число, и делают повторный посев, используя более разбавленные суспензии. Если в первом опыте учитываемые микро­организмы не выявляются, повторный высев производят из менее разбав­ленных суспензий. Количество посевного материала везде одинаково - 1 мл. После инокулирования среды пробирки выдерживают при температу­ре, благоприятной для развития выявляемых микроорганизмов. Время ин­кубирования зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют.

После инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микроор­ганизмов по характерным для данной группы признакам (визуально - по помутнению среды, образованию пленки или осадка, газовыделению идругим). Проводят качественные реакции на присутствие определенных продуктов жизнедеятельности в среде, образование которых должно со­провождать развитие изучаемых микроорганизмов (например, при разви­тии нитрифицирующих бактерий - появление в среде нитритов и нитра­тов).

Затем статистически обрабатывают результаты и пересчитывают. Вначале определяют наиболее вероятное количество клеток в единице объ­ема.

Чтобы получить достоверные результаты методом предельных разве дений, необходимо соблюдать особую тщательность и аккуратность во время приготовления разведений и посева.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОКМИКРООРГАНИЗМОВ И БИОМАССЫ НА ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРЕ

Фотоколориметрические методы находят широкое применение для количественных определений различных веществ и определения клеток микроорганизмов и их биомассы.

Микроорганизмы в большинстве случаев не окрашены и почти прозрачны, поэтому суспензия клеток поглощает свет в видимой области спек­тра незначительно. Уменьшение интенсивности света после прохождения через суспензию клеток связано главным образом с его рассеянием. В оп­ределенных пределах количество света, рассеиваемого суспензией микро­организмов, пропорционально содержанию клеток.

Общее количество рассеянного света пропорционально отношению размера частицы к длине волны падающего света. Следовательно, при данной длине волны падающего света рассеяние тем больше, чем крупнее клетки микроорганизмов, и для клеток данного размера светорассеяние тем больше, чем меньше длина волны падающего света. Поэтому опреде­лять количество клеток по интенсивности светорассеяния можно лишь для тех культур микроорганизмов, развитие которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием пленок мицелия или различных скоплений.

Питательная среда для микроорганизмов, в которой предполагается установить число клеток (биомассу) по светорассеянию, должна быть оптически прозрачной. Если помутнение среды связано с выпадением в осадок солей, чаще всего фосфатов, то перед измерением светорассеяния среду подкисляют несколькими каплями концентрированной соляной кислоты.

Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечи­вающий максимум пропускания света данной суспензией. Например, све­торассеяние суспензии сине-зеленых водорослей измеряют с зеленым фильтром, а суспензию бактерий в мясо-пептонном бульоне - с красным фильтром. При высоких концентрациях клеток в культуральной среде рас­сеяние света усиливается, что приводит к получению заниженных резуль­татов. Поэтому суспензии с высокой плотностью клеток перед измерением светорассеяния следует разводить средой или водой. Разбавление проб од­ной и той же культуры разными жидкостями недопустимо, так как набуха­ние и сжатие клеток влияет на величину светорассеяния. Величину свето­рассеяния измеряют на фотоэлектроколориметре (ФЭК).

Иногда рост микроорганизмов выражают в показаниях ФЭК. В большинстве же случаев строят кривую зависимости показаний ФЭКа о числа клеток или их биомассы и по этой кривой, предварительно измерив светорассеяние, определяют содержание клеток или вес сухой биомассы единице объема среды.

Для построения калибровочной кривой измеряют величину светорассеяния суспензий различной плотности. В каждой из суспензий определяю в счетной камере или по методу Брида количество клеток в 1 мл среды ил вес сухой биомассы в г/л (г/100 мл) питательной среды.

На основании полученных данных строят на миллиметровой бумаге калибровочную кривую, откладывая на оси ординат показания ФЭКа, а на оси абсцисс - количество клеток, содержащихся в 1 мл среды, или биомассы в 1 г/л.

Для каждой культуры микроорганизмов строят свою калибровочную кривую. На графике указывают номер светофильтра, рабочее расстояние кюветы, дату построения графика и для какой культуры он составлен.

Заключение: Работа с микроорганизмами с использованием количественных методов очень сложна и требует особой тщательности в проведении всех манипуляций, большого количества расходных материалов и обязательной статистической обработки полученных результатов. Только в этом случае можно быть уверенным в достоверности полученных результатов.

Дата добавления: 2015-07-25