Характеристика микробного роста. Целевые продукты

План 1. Методы контроля роста микроорганизмов

2. Понятие первичных и вторичных метаболитов. Целевой продукт.

3. Ингибирующие и лимитирующие рост факторы среды.

4. Примеры регуляции направления метаболизма

5. Коэффициенты характеризующие рост микроорганизмов.

6. Методы музейного хранения микроорганизмов.

Введение: Изучение роста микроорганизмов обычно начинают с исследования периодической культуры. Цикл развития ее не имеет аналогии с развитием многоклеточного организма и проходит несколько стадий: лаг - фазу, фазу экспоненциального роста, стационарную и фазу отмирания. Изменяя условия культивирования, в первую очередь питательной базы, можно добиться изменения состава биомассы и продуктов микробного метаболизма.

Начинающийся рост отслеживают по ходу накопления биомассы и интересующего продукта а так же по потреблению исходного основного сырья. Пробы необходимо отбирать достаточно часто, чтобы уловить фазы экспоненциального роста и накопления максимума биомассы и целевого продукта. Строят графические зависимости этих показателей и выясняют, является ли целевой продукт (кислоты, спирты, кормовой белок, витамины антибиотики и пр.) первичным – связанным с ростом и накоплением биомассы.

Либо он вторичен - то есть выросшая биомасса перерабатывает оставшийся недоиспользованным субстрат или полученные в первой фазе продукты.

Наличие вторичных продуктов, в отличие от первичных, для жизни продуцента необязательны, но образуются в том случае, когда для дальнейшего роста каких либо компонентов может не хватать, но в среде есть вещества, которые микроорганизм способен перерабатывать и получать энергию для жизни. Возникают в это время проблемы лимитирования роста клеток (недостатка компонентов для внутриклеточных синтезов), либо ингибирования (торможения жизненно важных процессов, отравления продуктами собственного метаболизма). Эти процессы могут происходить одновременно и в разные периоды жизни культуры, но обычно на более поздних стадиях – стационарной и отмирания.

При получении продуктов второй фазы требуется вначале создать оптимальные условия для роста биомассы продуцента, а затем лимитировать определенный компонент при сохранении достаточных количеств других факторов.

Во вторую фазу могут осуществляться и сверхсинтезы продуктов первой фазы, когда вещества для нормального роста полностью исчерпываются,но в среде имеются ферменты и вещества, участвующие в синтезе продуктов нормального метаболизма первой фазы, не важные для продуцента во время избытка питательных веществ. Например, витамины.

Среди продуктов вторичного синтеза встречаются искаженные вещества распада клеток предыдущего поколения,за счет которых может происходить накопление сложных комплексных производных, не характерных для роста культуры в нормальных условиях.

Кроме того, при экстремальных для штамма условиях большая вероятность возникновения в культуре разного рода мутантных форм, которые не способны к жизни в нормальных условиях среды, не обладают способностями к желаемому синтезу, но могут вытеснить из культуры исходных продуцентов, так как энергия их роста значительно ниже.

Большинство промышленных микробиологических процессов ведутся на сложных средах, использующих отходы других производств или с/х, на них можно определить оптимальные соотношения и фазу наиболее активного роста и биосинтеза целевого продукта, скорость,продуктивность процесса, выявить оптимальную температуру, рН, степень аэрации. Для получения продуктов первой фазы - первичных метаболитов этого вполне достаточно. Но здесь сложно установить конкретный лимитирующий фактор, (азот углерод фосфор витамины) который вызывает синтез продуктов второй фазы.

Этот вопрос разрешим только на синтетических или полусинтетических средах. Применяя разные среды с заранее предусмотренным ограничением роста клеток, выявляют нужный для конкретного вторичного синтеза элемент, ингибирующий или лимитирующий фактор, нужные концентрации других веществ. Очень часто проводится математическое планирование экспериментов для подбора условий и оптимизации состава сред для максимальных выходов целевого продукта, но они не могут полностью заменить изучение физиологических потребностей продуцентов.

Экономический коэффициент определяется, как соотношение увеличения кол-ва биомассы при соответствующем потреблении субстрата. Он рассчитывается для культуры в стадии экспоненциального роста для любого из элементов питания или кислорода. В других фазах роста, вследствие лимитирования или ингибирования, экономический коэффициент снижен.

Метаболический коэффициент это удельная скорость метаболизма или физиологическая активность. Он рассчитывается исходя из скорости потребления субстрата и образования продукта для каждого промежутка времени, непостоянен и зависит от скорости роста и условий культивирования.

Затраты на поддержание жизни. Неразмножающиеся или отравленные клетки постепенно отмирают, однако при наличии минимального кол-ва энергетического субстрата они способны некоторое время существовать и поддерживать жизнь за счет окисления его и получения энергии, которая идет на физиологическую адаптацию к неблагоприятным условиям, на необходимый оборот клеточного материала, поддержание гравитационных градиентов концентрации. Эти траты поглощают основную часть энергии так как репарация (восстановление) поврежденной клетки требует бОльших усилий и не всегда приводит к сохранению жизни.

Контроль за процессами роста достаточно сложен при ручном отборе проб, поэтому в промышленных производствах его необходимо максимально автоматизировать, применяя датчики концентраций питательных веществ среды, рН, температуры, величины параметров окислительно-восстановительного потенциала, растворенных в среде газов, осмотического давления и пр.

Для роста аэробных культур следует предусмотреть поддержание оптимальное значение концентрации растворенного кислорода в среде, но как недостаток, так и избыток его вреден. Поэтому приток кислорода рассчитывается исходя из условий роста культуры, конкретной среды и потребностей продуцента, учитывая при этом степень абсорбции кислорода элементами среды и интенсивность массообмена (перемешивания и усреднения)

ХРАНЕНИЕ микроорганизмов ставит перед собой задачу поддержание не только жизнеспособности и стабильности таксономически важных признаков, но и определенных свойств и активности по отношению к субстратам. Проблемой при этом является создание условий анабиоза. т.е торможения процессов обмена веществ.

Хранение осуществляется в специализированных коллекциях типовых культур бактерий, мицелиальных грибов, дрожжей, водорослей, простейших, вирусов, культур тканей растений и животных.

В мире насчитывается более 500 коллекций.

Они испрользуют следующие методы:

- периодические пересевы. (субкультивирование) применяется для аспорогенных культур, не выдерживающих замораживание или высушивание один-два раза в месяц. Спорообразующие бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы через три месяца. Время инкубации перед началом хранения не должно превышать фазу экспоненциального роста, т.к. в начале стационарной фазы клетки лучше переносят неблагоприятные условия.

Для хранения следует использовать генетически однородную популяцию не плотной среде, полученную из одной родительской клетки. Хранят в темноте на скошенном агаре в пробирках при температуре от 5 до 20⁰С.Недостатки метода: частые пересевы иногда приводят к утрате производственных свойств, клетки изменяют свои первоначальные свойства. Преимущество метода в простоте, удобном визуальном контроле чистоты а так же возможной морфологической изменчивости.

- Лиофилизация- это метод культуры высушивания клеток выращенных на твердом агаре и замороженных, а затем быстро высушенных в щадящем режиме.

- условия низких и ультранизких температур (криофилизация).

В условиях небольших лабораторий замораживание густых суспензий клеток ведется в сосудах Дюара.В качестве криоагентов используется смесь льда с поваренной солью 3:1 имеющую температуру -21 ⁰С.

Смесь льда с хлористым кальцием 2:1 температура -56 ⁰С. Твердая углекислота -78 ⁰С.В крупных коллекциях ведется замораживание в жидком азоте: газофазном температура -130 \-170 ⁰С.

Жидкофазный -196 ⁰С Так хранятся микроорганизмы, погибающие при лиофилизации (спирохеты, микроплазмы, вирусы и стартовые культуры молочно кислых бактерий)

Грамположительные бактерии более устойчивые чем грамотрицательные.

При высоких скоростях охлаждения образуются внутриклеточные кристаллы льда, которые разрывают мембраны, поэтому величина кристаллов определяет выживаемость клеток. Считается, что медленное охлаждение приводит к меньшим повреждениям клеток

- высушивание- может быть применимо к спорообразующим и грибам.

- хранение под слоем масла- для анаэробов.

Вывод. Изучение процессов роста микробных культур и влияния основных факторов на состояние клеток, накопление целевых продуктов метаболизма является основной задачей биотехнологии. Знание этих закономерностей позволяет регулировать и интенсифицировать получение необходимых продуктов, обеспечивать наиболее полное и продуктивное использование субстратов.

Дата добавления: 2015-07-25