Материалы и методы

В исследовании приняли участие 14 учреждений здравоохранения и образования Республики Беларусь: Гомельский государственный медицинский университет, Брестский областной онкологический диспансер, Гродненская областная клиническая больница, Могилёвский областной онкологический диспансер, Гомельский областной клинический онкологический диспансер, Минский городской клинический онкологический диспансер, Бобруйский межрайонный онкологический диспансер, Городской родильный дом №2 г. Минска, кафедра онкологии БелМАПО, кафедра акушерства и гинекологии Витебского государственного медицинского университета, женские консультации №2, 4, 6 г. Гродно, Гродненский областной родильный дом.

За 2009 - 2010 год была сформирована коллекция биологических образцов для определения ДНК онкогенных типов папилломавирусов, компьютерная база данных пациентов, включённых в научно-исследовательский протокол, отработана методология отбора биологического материала для определения ДНК HPV методом полимеразной цепной реакции, позволяющая добиться оптимального качества образцов и снизить количество ложно-негативных результатов, подобраны праймеры для молекулярно-генетического анализа генов E6\E7 ВПЧ и CpG-гиперметилирования локуса р16ink4A и отработаны условия проведения ПЦР для определения гиперметилированных участков гена р16ink4A и генов E6\E7 ВПЧ, оценена их роль для клинической практики, проведён анализ распространённости генотипов HPV высокого онкогенного риска на территории Республики Беларусь, разработаны алгоритмы диагностики ВПЧ-инфекции с использованием методов качественной и количественной ПЦР-диагностики.

Отбор биологического материала для определения генотипов вируса папилломы человека высокого онкогенного риска был выполнен у женщин, проживающих на территории всех шести областей республики: у 254 пациенток, проживающих в Гомельской области, 127 пациенток, проживающих в Брестской области, 115 женщин из Гродненской области, 226 женщин, проживающих в Могилёвской области, 95 женщин из Витебской области и 104 женщин из города Минска и Минской области, всего отобран 921 образец эпителия шейки матки.

Возраст женщин варьировал от 18 до 75 лет (средний возраст 29,3 года). Отбор биологических образцов проводился у пациенток с предраковой патологией и раком шейки матки и вульвы, кондиломатозом наружных половых органов, влагалища и шейки матки, койлоцитозом многослойного плоского эпителия, хроническим цервицитом и клинически здоровых женщин.

Были использованы следующие методы исследования: расширенная кольпоскопия, цитологический и гистологический методы исследования, для определения генотипов HPV использовался метод полимеразной цепной реакции, количественная ПЦР в режиме реального времени.

Метод простой и расширенной кольпоскопии, вульвоскопии был использован для выявления эпителиально-сосудистых тестов и визуализации патологических очагов в эпителии шейки матки, влагалища и вульвы, что позволило повысить эффективность верификации диагноза цитологическим и гистологическим методом, а также обеспечить эффективный отбор соскобов при очаговой форме HPV-инфекции.

Одним из кольпоскопических проявлений эписомальной формы персистенции HPV-инфекции, которая выявляется с помощью морфологических маркёров (койлоцитоза многослойного плоского эпителия) и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), является изменение рельефа эпителия шейки матки. Гладкий бледно-розовый здоровый МПЭ шейки матки в случае персистирующей HPV-инфекции деформирован мелкими сосочками по типу «манной крупы», при обработке 3% уксусной кислотой может давать картину ацетобелого эпителия. При взятии биопсии из таких очагов, как правило, получаем заключение койлоцитоз, акантоз МПЭ, базально-клеточная гиперактивность. Вирусная инфекция может диффузно поражать эпителий шейки матки, а может располагаться очагами или быть локализована даже в одном очаге. Поэтому при взятии соскоба эпителия для определения ДНК HPV высокого онкогенного риска методом ПЦР, без предварительной оценки состояния эпителия методом расширенной кольпоскопии и при очаговом поражении эпителия шейки матки, можно получить ложно-негативный результат, если исследователь не попал в микроскопический очаг накопления вирусных частиц.

Простая и расширенная кольпоскопия проводились по стандартной методике.

Цитологический метод исследования является необходимым этапом верификации преклинических и субклинических патологических процессов, вызванных онкогенными типами папилломавирусов. Забор материала для цитологического исследования проводился после устранения слизистой пробки с поверхности шейки матки марлевым тампоном, поверхностный эпителий из влагалищной части шейки матки и из цервикального канала проводился двумя разными цитощётками на два покровных стекла, для дифференцировки локализации патологического процесса в экто- и/или эндоцервиксе.

Разрешающая способность цитологического метода варьирует в широких пределах. Согласно результатам мета-анализа 1995 года [13], в котором была проведена оценка разрешающей способности цитологического метода диагностики патологии шейки матки, было отмечено:

1. Чувствительность цитологического метода – 11-99%

2. Специфичность цитологического метода – 14-97%

3. Уровень ложно-негативных мазков при цервикальной интраэпителиальной неоплазии 3 степени – 5-55%.

4. Морфологический маркёр HPV-инфекции - койлоцитоз многослойного плоского эпителия – может быть определён в 30-50%..

Даже в странах, использующих популяционный скрининг рака шейки матки методом PAP-теста, ПЦР – диагностика HPV-HR на сегодняшний день рассматривается как дополнение или альтернатива традиционному скринингу.

Гистологический метод исследования является основополагающим для верификации диагноза предрака и рака шейки матки, вульвы и влагалища. Биопсия проводилась конхотомом при обязательной визуализации патологического участка эпителия посредством расширенной кольпоскопии (прицельная биопсия), соскоб из цервикального канала – ложечкой Фолькмана. Полученный для гистологического исследования материал фиксировали в 10% растворе формалина, проводили через спирт, ацетон и хлороформ, а после заливки в парафин готовили срезы толщиной 5-6 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином и заключали в полистирол под покровные стекла. Микроскопию проводили при увеличении х400 и х600.

Метод полимеразной цепной реакции использовался для определения онкогенных типов папилломавируса. Материалом для исследований служили соскобы эпителия и биоптаты шейки матки, влагалища, вульвы. Забор материала производился с использованием цитощетки, урогенитального зонда или конхотома на транспортную среду. Генотипы HPV-HR определены методом ПЦР в 182 образцах, полученных от пациенток из г. Гомеля и Гомельской области.

Для постановки реакции использовались коммерческие ПЦР-тест-системы «АмплиСенс» производства Центрального Научно-Исследовательского Института Эпидемиологии Министерства здравоохранения России с электрофоретическим учетом и Real-Time-PCR. АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип для выявления и генотипирования ДНК HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов, а также тест на количественную детекцию ДНК HPV-HR в режиме Real-Time-PCR.

В наборах применялся метод одновременной амплификации (мультиплекс-ПЦР) участков ДНК Е1-E2 генов HPV и участка ДНК b-глобинового гена, используемого в качестве эндогенного внутреннего контрольного образца (ВКО). ДНК-мишень, выбранная в качестве внутреннего контроля, является участком генома человека и должна всегда присутствовать в образце. Эндогенный внутренний контроль позволяет не только контролировать этапы ПЦР-анализа (выделение ДНК и проведение ПЦР), но и оценивать адекватность забора материала и его хранения. В случаях, если соскоб эпителия забран неправильно (недостаточное количество эпителиальных клеток) сигнал амплификации β- глобинового гена будет заниженным.

Амплификация проводилась на приборе «Rotor-Gene-3000». Выделение ДНК производилось несколькими методами: ручным – SDS-метод (фенол-хлороформный) и сорбцией на силикагеле, и автоматическим – при помощи прибора «Robotics» фирмы «Corbett Research».

Дата добавления: 2015-07-16